固相膜免疫分析技术

标题（黑体40号）,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,标题（黑体40号）,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,标题（黑体40号）,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,标题（黑体40号）,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,固相膜免疫分析技术,固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术,目 录,第一节 概 述,第二节 免疫层析试验,第三节 免疫渗滤试验,第四节,斑点酶免疫吸附试验,第五节,免疫印迹试验,第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素,第七节 固相膜免疫分析技术的临床应用,第一节 概 述,重点提示,固相膜免疫分析技术,常用的固相膜和标志物,固相膜的技术要求,固相膜免疫分析技术,是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜渗滤作用或毛细管虹吸作用使样本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物或酶标记物与之反应形成肉眼可见的显色结果。,常用的固相膜,玻璃纤维素,(fiberglass),膜尼龙（,nylon,）,膜硝酸纤维素（,nitrocell-ulose,，,NC),膜,NC,膜或尼龙膜是常用的固相膜,常用的标志物,酶和有色微粒子,彩色胶乳,荧光素,胶体金和胶体硒等,其中以胶体金和荧光素最为常用,固相膜的技术要求,孔径：,穿流法的膜一般选择,0.4m,左右；横流法的膜可选择,5m10m。,流速：,孔径和分布结构影响膜的流动速率，孔径大，流速快。,蛋白质结合力：,吸附力很强，以,g,/,cm,2,表示。,均一性：,优质的膜具有良好的均一性。,第二节 免疫层析试验,重点提示,原理,常用的免疫层析试验,胶体金免疫层析试验的测定模式,荧光免疫层析试验,技术要点,原 理,免疫层析试验是以硝酸纤维素膜为固相载体，样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动，同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体（抗原或抗体）发生高特异性、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过检测标记物胶体金颗粒或荧光素等，在短时间内（,20min),聚集而得到直观的试验结果（显色）。,常用的免疫层析试验,根据标记物的不同，免疫层析试验可以分为：,胶体金免疫层析试验：,标记物为胶体金，多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。,荧光免疫层析试验：,标记物为荧光素，标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。,胶体金免疫层析试验的测定模式,双抗体夹心法检测大分子抗原,竞争法检测小分子抗原,间接法,双抗体夹心法检测大分子抗原,G,处为金标特异性抗体，,T,处为包被特异性抗体，,C,处为包被抗免疫球蛋白抗体，,B,处为吸水纸。测试时,A,端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向,B,端移动，流经,G,处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体,-,抗原复合物，移至,T,区时，形成金标抗体,-,抗原,-,抗体复合物，金标抗体被固定下来，在,T,区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至,C,区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。,图,11-1,免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图,竞争法检测小分子抗原,图11-2 免疫层析试验竞争法原理示意图,G,处为金标抗体，,T,处包被标准抗原，,C,处包被抗金标抗体，测试时待测标本加于,A,端，若待测标本中含有待测抗原，流经,G,处时结合金标抗体，当混合物移至,T,处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，,T,处无红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经,C,处，与该处的抗金标抗体结合出现红色的质控带，若标本中不含待测抗原，金标抗体则与,T,处膜上的标准抗原结合，在,T,处出现红色的线条，实验结果为阴性。,间接法,利用间接法检测抗体时，待测血清标本中大量的非特异性,IgG,可以与特异性,IgG,竞争性结合胶体金标记的抗人,IgG,，从而影响试验的敏感性，为了消除其影响，常采用反流免疫层析法排除非特异性抗体对测试的干扰。,荧光免疫层析试验,荧光免疫层析试验是在免疫层析技术的基础上，采用荧光素标记相应的抗体或抗原，然后利用荧光检测仪检测试剂条上富集的反应结合物激发产生的荧光强度，从而对标记物浓度进行检测的一种方法。荧光免疫层析实验与胶体金免疫层析实验的基本步骤是一样的，但所用的标记物不一样，前者采用的是荧光素，后者采用的是胶体金。常用的方法有夹心法、竞争法等。,技术要点,胶体金层析试验：,加样、结果判定。,荧光层析试验：,不同的荧光标记物具有不同的检测波长，需根据试剂盒的荧光标记物的特性，选择合适的检测波长，或使用试剂盒提供的专用荧光检测仪器。,第三节 免疫渗滤试验,重点提示,原理,测定模式,技术要点,原 理,DIGFA是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加样品、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上的相应抗原或抗体发生反应，起到亲和层析的浓缩作用，达到快速检测的目的。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。,测定模式,1.,双抗体夹心法测抗原：,A,B,包被抗体的试纸,滴加金标抗体,滴加待检样品于试纸上,测定模式,2.,间接法测特异性抗体：,试剂盒组成,主要由渗滤装置、胶体金标记物、洗涤液、抗原参照品或抗体阳性对照品四部分组成。其中渗滤装置是由塑料小盒、吸水垫料和已点加抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。试剂盒一般都设有质控点，质控点的大小或形状都不同于检测点，有的用大小点区分、有的用点横线区分，有的用横竖线区分。,图11-3 DIGFA结构示意图,技术要点,加 样：,将渗滤装置平放于实验台面上，于小孔内依次滴加含待测样品及相应的试剂。,结果判定：,在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地表示阳性反应的强弱。,第四节 斑点酶联免疫吸附试验,重点提示,原理,技术要点,方法学评价,原 理,Dot-ELISA,的实验原理与常规的,ELISA,相同，不同之处在于,Dot-ELISA,所用载体为,NC,膜。其原理为样品中的抗体或抗原与预先包被在,NC,膜上的抗原或抗体发生抗原抗体反应，然后再加入相应的酶标二抗进行反应，反应结束后，通过酶催化底物，形成有色的沉淀物，产生显色反应，根据染色条带或斑点的有无或深浅，对抗体或抗原进行检测。阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色条带或斑点。,图11-4,Dot-ELISA,示意图,技术要点,抗原包被：,优化抗原的浓度。,抗原抗体反应：,滴加样品血清，待检抗体与NC膜上抗原结合。,确定酶结合物最佳稀释度：,一般以阴性样品不显色而阳性样品显色最强的酶结合物稀释度为最佳稀释度。,显色反应：,在盐酸联苯胺和过氧化氢为底物时，溶液pH值应在5.86.0，此时反应最灵敏。,方法学评价,优点：,1.吸附蛋白能力强,2.可同时检测多种抗体,3.其它：,实验和结果判断不需特殊设备条件，结果可长期保存,第五节 免疫印迹试验,重点提示,原理,技术要点,方法学评价,原 理,技术要点,抗原印迹与包被,抗原抗体反应,检测,抗原等蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至硝酸纤维素膜上,放射自显影法,底物化学发光法,底物荧光法和底物显色法,方法学评价,特异性强，,用于病原体,确认,1,3,同时检测多种抗体,4,膜条可重复检测应用,吸附蛋白,能力强,2,2,第六节 影响固相膜免疫试验的主要因素,重点提示,试剂方面,标本方面,实验过程,影响因素：试剂,试剂的选择：,注意试剂的注册号、批号、有效期和检验合格证等；不同批号的试剂不能混用；不能使用过期的试剂。,试剂的准备：,试剂在开封前应检查是否漏液、漏气；使用前要在室温（1825）下平衡20min30min。,影响因素：标本,标本处理：,临床检测的标本有痰液、尿液、粪便、棉拭子、血清和血浆等。检测前，需进行相应的前处理，如痰液或粪便，需用缓冲液或生理盐水稀释后，低速离心，取上清进行检测。,标本保存：,对于采集的标本如不能立即检测，需要保存在28，不超过24小时，超过24小时以上，需保存在-20以下，忌反复冻融。,影响因素：实验过程,温度及时间,结果判定,检测前要平衡至,室温（1825）,后再开袋使用。,无特殊说明，检测的温度为1825，时间在3Omin以内。,一些胶体金诊断试剂条只用于初步诊断， 确诊需采用免疫印迹实验进行。,试剂条平衡,第七节,固相膜免疫分析技术的临床应用,谢谢！,