分子生物学第4章

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 蛋白质生物合成,第一节 参与蛋白质合成的物质,一、,mRNA,从,DNA,传递遗传信息,1,、,mRNA,的一级结构,(1)5,非翻译区,(5-UTR),：,5,端,起始密码子，含,核糖体结合位点,(RBS),，即核糖体赖以装配并启动翻译的一段序列,(2),编码区,(coding region),：起始密码子,终止密码子（主要序列）,从原核生物操纵子转录的,mRNA,有多个编码区，相邻编码区被一个,RBS,隔开，这种,mRNA,称为,多顺反子,mRNA,(,Polycistronic,mRNA),；,真核生物多数,mRNA,只有一个编码区，这种,mRNA,称为,单顺反子,mRNA,（,monocistronic,mRNA,）,(3)3,非翻译区,(3-UTR):,是从,mRNA,的终止密码子之后到,3,，端的一段序列,原核,mRNA,的一级结构模式,真核,mRNA,的一级结构模式（哺乳动物）,2,、密码子,遗传密码（,genetic code,）：,是,mRNA,分子,上按照,53,方向,，每三个核苷酸与一种氨基酸对应，全部,64,种组合所形成的,体系,。,密码子（,codon,）：,从,mRNA,编码区,53,端,每三个相邻碱基一组连续分组，每一组碱基构成一个遗传密码，称为密码子，也叫三联体密码（,triplet code,）。,每一个密码子与特定的一种氨基酸相对应。,终止密码（,stop,coden,）：,也称无意密码子（,nonsense,coden,）：没有对应的,tRNA,的反密码子与之结合，但能被蛋白质合成的终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。,终止密码有,3,个：,UAA,、,UAG,、,UGA,起始密码,：,AUG,，是多肽链翻译开始的第一个密码子，在链内部则作为蛋氨酸的密码子。,密码子特点,1.密码的,连续性,(commaless),2.密码的,简并性,(degeneracy),3.密码的,通用性,(universality),连续性,编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码,连续阅读,，密码间既,无间断也无交叉,。,三联子密码是连续的,(,commaless,),和非重叠,(non-overlapping),即每个碱基,都参与,构成密码子,且只,参与构成,一个,密码子,简并性,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为,简并,（,degeneracy,），对应于同一氨基酸的密码子称为,同义密码子,（,synonymous,codon,）。,密码子前两位碱基相同，第三位碱基不同仍编码相同的氨基酸,简并性现象决定了,“同义突变”,的存在，即,DNA,或,mRNA,序列中,一个核苷酸的改变（点突变）可能并不影响其编码的多肽链中氨基酸的性质和序列,。减少了变异对生物的影响,除,色氨酸（,UGG,）和甲硫氨酸（,ATG,）,只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子：,9,种氨基酸有,2,个密码子，,1,种氨基酸有,3,个密码子，,5,种氨基酸有,4,个密码子，,3,种氨基酸有,6,个密码子。,偏爱性,（,preference,）,编码同一种氨基酸的几个同义密码子在基因组中的,使用频率可能不同,，使用频率高的称为,偏爱密码子,(Preferred,codon,),，使用频率低的称为,稀有密码子（,rare,codon,),原核生物和真核生物有着各自的密码偏爱性，如：脯氨酸的密码子有,CCC,（真核生物）和,CCG,（原核生物）,某一种密码子的使用频率与,细胞内相应的,tRNA,的丰度,一致，二者之间的相互协调有利于细胞内某一氨基酸含量高的蛋白质的顺畅表达,通用性,蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。,理论意义：这对,进化过程,中生物物种的稳定性及物种之间的相互联系与沟通是十分重要的。,实践意义：这对现代,基因工程,，利用,低等细胞,生成包括人类在内的,高等哺乳动物基因产物,提供了可能性。,已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。,3,、阅读框（,reading frame,）,阅读框,：,mRNA,分子上从一个起始密码子到其下游第一个终止密码子所界定的一段编码序列,mRNA,中的编码序列在,被核糖体阅读和翻译时,，从起始到终止都是以不重叠和不停顿的方式连续进行的，即从,mRNA5,端开始，以三个核苷酸为一组的方式进行。因此，就有可能存在,三种阅读框架,，每一种框架只相差一个碱基的位移。三种框架的出现完全取决于哪一个核苷酸作为第一个密码子的第一个碱基。,通常情况下，在三种框架中，只有一种能够正确地编码有功能活性的蛋白质，而其它的阅读框架往往,由于频繁出现终止密码子,而被封闭,开放阅读框架（,open reading,frame,ORF,）,：指,从,AUG,开始,到,终止密码子,处的,正确可读序列,。,基因损伤引起,mRNA,阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变,(,frameshift,mutation),。,二、,tRNA,既是氨基酸转运工具又是读码器,一种氨基酸可能有几种,tRNA,，它们称为,同工,tRNA,一种,tRNA,可能识别几个不同的密码子,，但它们一定是同义密码子,研究发现,:,mRNA,密码子的第三碱基,和,tRNA,反密码子的第一碱基,为摆动位置,(wobble position),，该位置存在非,Watson-Crick,碱基对,1966,年，,Crick,摆动假说,(wobble hypothesis):,1,反密码子的第二、三碱基与密码子的相应碱基形成,Watson-Crick,碱基对，对密码子的特异性起决定作用,2,反密码子的第一碱基决定其识别的密码子数,3,第一、二碱基存在区别的同义密码子由不同的,tRNA,识别,4,识别,61,个密码子至少需要,32,种,tRNA,，其中包括一种起始,tRNA,一个,tRNA,究竟能识别多少个密码子是由反密码子的第一位碱基的性质决定的。,完整的核糖体复合体有三个,tRNA,结合位点,:,A,位点 （,aminoacyl,site,）,结合氨酰,tRNA,P,位点,(,Peptidyl,site,）,结合肽酰,tRNA,E,位点,(exit site),结合脱酰,tRNA,A,位点和,P,位点定位于,30S,小亚基与,50S,大亚基的结合区域，,E,位点定位于,50S,大亚基上,三、核糖体是蛋白质的合成机器,第二节 氨基酸的负载,氨基酸负载：指,氨酰,tRNA,合成酶,催化,氨基酸,与相应的,tRNA,缩合生成,氨酰,tRNA,氨酰,tRNA,中的氨酰基与,tRNA,以,高能酯键,连接，所以氨基酸负载也称为,氨基酸活化,1,氨基酸必须由,tRNA,负载,2,负载由氨酰,tRNA,合成酶催化,氨酰,tRNA,合成酶有,20,种，每一种都识别并催化一种氨基酸与其,tRNA,(,包括同工,tRNA,),的,3-,羟基连接,具有,高度特异性（,对底物氨基酸和,tRNA,),具有校正活性,作为,共同的书写规则,，用,tRNA,Gly,表示将要接受甘氨酸（,Glysine,）的,tRNA,，而用,Gly-tRNA,Gly,表示对应的氨基酰,-,tRNA,3,原核生物起始,Met-,tRNA,fMet,需要甲酰化,在细菌中，起始氨基酸是,甲酰甲硫氨酸,；所以，与核糖体小亚基相结合的是,N-,甲酰甲硫氨酰,-,tRNA,fMet,，可以,与延伸中的,Met-,tRNA,Met,区分开。,真核生物中，多肽合成是从生成,甲硫氨酰,tRNAi,Met,开始的，体内存在,两种,tRNA,Met,。只有甲硫氨酰,tRNAi,Met,能与,40S,小亚基相结合，起始肽链合成，普通,tRNA,Met,携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中。,第三节 原核生物蛋白质的合成,蛋白质生物合成的过程是由,一组,RNA,相互协调配合，共同作用的结果,蛋白质生物合成的概况如下：以,mRNA,作为模板，核糖体从,mRNA,的,53,方向,进行阅读，,蛋白质合成的方向是,N,端,C,端,。,翻译过程依赖于氨基酰,-,tRNA,来搬运特异的氨基酸，并借助于自身的反密码子，通过密码反密码之间的碱基配对来识别,mRNA,上的对应密码子,翻译过程是在核糖体上进行的，大致可以区分为三个步骤，即,起始、延长和终止,。,一、翻译起始,核糖体与,mRNA,、,fMet-tRNA,fMet,装配成,70S,起始复合体的过程,包括,核糖体解离,30S,小亚基与,mRNA,结合,30S,起始复合体形成,70S,起始复合体形成,1,、核糖体解离,需要翻译起始因子,IF-l,和,IF-3,IF-1,加强,IF-2,，,IF-3,的酶活,IF-2,促使,fMet-tRNA,fmet,选择性结合在,30S,亚基上,IF-3,促使,30S,亚基结合于,mRNA,起始部位,，具有解离,30S,与,50S,亚基的活性,2,、,30S,小亚基与,mRNA,结合,SD,序列（,Shine-,Dalgarno,Sequence,）：,原核生物,mRNA,的核糖体结合位点，位于,5,非翻译区，包括起始密码子上游,8-13nt,处的一段保守序列,S-D,序列,是原核细胞中,mRNA,和核糖体识别、结合,的位点。,S-D,序列具有保守序列：,5-AGGAGGU-3,。,原核细胞,核糖体小亚基,16SrRNA,具有,3-UCCUCCA-5,保守序列，二者正好互补，核糖体借此判定翻译的起始位点,30S,小亚基与翻译起始因子,IF-l,，,IF-3,的作用下通过,mRNA,的,SD,序列与之相结合。,A,U,G,5,3,IF-3,IF-1,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,30S,起始复合体构成：,30S,小亚基、,mRNA,、,fMet-tRNA,fMet,、,GTP,、,IF-I,、,IF-2,、,IF-3,各一分子,A,U,G,5,3,只有,fMet-tRNA,fMet,能与第一个,P,位点,相结合，其他所有,tRNA,都必须通过,A,位点到达,P,位点，再由,E,位点离开核糖体,3,、,30S,起始复合体形成（,在,IF-2,和,GTP,的帮助下，,fMet-tRNA,fMet,进入小亚基的,P,位，,tRNA,上的反密码子与,mRNA,上的起始密码子配对）,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,带有,tRNA,、,mRNA,和,3,个翻译起始因子的小亚基复合物与,50S,大亚基结合，,GTP,水解，释放翻译起始因子。,A,U,G,5,3,4,、,70S,起始复合体形成,二、翻译延长,肽链的延伸过程实际上是一个,循环反应,每一个循环包括三步反应，即,进位（,entrance,）,成肽,(peptide bond formation),移位,(translocation),每一个循环使肽链延长一个氨基酸长度,进位,：,mRNA,上,第二个密码子对应的氨基酰,-,tRNA,结合到核糖体小亚基上的,A,位,，该结合反应需要,GTP,，并为延长因子,EF-T,所催化。,（,GTP/EF-T,）,AA2-tRNA A,位,成肽,：,在,肽酰基转移酶,的催化下，在,P,位上氨基酰的,C-,末端,与,A,位上氨基酰,-,tRNA,的氨基之间,形成肽键；,（肽酰基转移酶）,C-,端（,P,位）,+ N-,端（,A,位）,肽键,是由转肽酶,/,肽基转移酶,催化,肽链合成方向,N,端,C,端,转位,：,在其后的转位过程中，由于,tRNA,的离开而空出,P,位，,新生的肽酰基,tRNA,即从,A,位移至,P,位,，,核糖体沿着,mRNA,移动一个密码子的距离,，刚好使其进入,A,位；,如此反复循环，肽链不断延伸。,延长因子,EF-G,有转位酶,(,translocase,),活性，可结合并水解,1,分子,GTP,，促进核蛋白体向,mRNA,的,3,侧移动 。,fMet,A,U,G,5,3,fMet,Tu,GTP,三、翻译终止,当三个,终止密码子中的任何一个出现在,A,位,时，将促使与释放因子的结合，进而激活一系列终止过程,包括：肽基转移酶活性改变、,P,位点肽酰,tRNA,水解，,多肽水解、,tRNA,和,mRNA,脱落核糖体、核糖体分解为大、小亚基等，然后肽链合成进入新的一轮循环,1,、终止过程,2,、释放因子,RF-1,：识别终止密码子,UAA,和,UAG,RF-2,：识别终止密码子,UAA,和,UGA,RF-3,：,不识别终止密码子,，但具有核糖体依赖性,GTP,酶活性，与,GTP,结合之后可以协助,RF-1,或,RF-2,使翻译终止,3,、多核糖体循环,两种方式提高翻译效率,（,1,）多个核糖体同时翻译一个,mRNA,分子,：,在蛋白质合成的过程中，往往,几个核糖体同时附着在同一条,mRNA,链上，形成所谓的“多聚核糖体”（,polyribosome,）,结构。,（,2,）核糖体循环：,核糖体在一轮翻译完成之后，解离成亚基，回到,mRNA,的,5,端，重新装配，开始新一轮翻译合成,蛋白质合成的实际情况是当一个核糖体已经沿着,mRNA,链滑动到,3,端，新生肽链将要合成完毕时，而在,mRNA,的,5,端，核糖体的亚单位可能刚开始组装和启动肽链的合成,4,、转录与翻译偶联,第四节 真核生物蛋白质的合成,一、翻译的起始,与原核生物有几点不同,:,真核生物起始,Met-,tRNAi,不需要甲酰化,真核生物,mRNA,没有,SD,序列,，核糖体结合位点是其,5,端帽子结构,真核生物,mRNA,含,Kozak,序列,，其包含的起始密码子是翻译起始位点,真核生物的,mRNA,没有,S-D,序列，核糖体（小亚基）识别,5,端帽子,结构，随后移动到起始密码子处。,起始密码子常处于,-CCRCC,AUG,G-,序列之中，这段保守序列的存在,能增加翻译起始的效率,，这段序列即,Kozak,序列,。,1,、,Kozak,序列（起始扫描模型）,真核生物的,mRNA,没有,S-D,序列，核糖体（小亚基）识别,5,端帽子结构，随后移动到起始密码子处。,起始密码子常处于,-CCACC,AUG,G-,序列之中,，这段保守序列的存在能增加翻译起始的效率，这段序列即,Kozak,序列。,2,、翻译起始因子,真核生物翻译起始因子的符号都以,eIF,表示，与原核生物翻译起始因子具有相同功能的真核生物翻译起始因子用同一编号,功能包括,:,参与识别,mRNA,的帽子,参与形成,80S,起始复合体,某些翻译起始因子是翻译调控点,3,、真核生物翻译起始复合物形成,(,区别原核生物,),原核生物,:,30S,小亚基,首先与,mRNA,模板,相结合，再与,fMet-tRNA,fMet,结合，最后与,50S,大亚基结合。,真核生物,: 40S,小亚基,首先与,Met-,tRNA,Met,相结合，再与模板,mRNA,结合，最后与,60S,大亚基结合生成,80SmRNAMet-tRNA,Met,起始复合物。,二、翻译延长,三、翻译终止,终止阶段基本一致，释放因子有区别,真核生物有两种释放因子,:,eRF1,和,eRF3,eRF1,可以识别全部三种终止密码子,eRF3,具有,GTP,酶活性，作用与原核生物的,RF3,一致,四、多核糖体循环,环状多核糖体,第五节 蛋白质的翻译后修饰,翻译后修饰,(Post-translational modification),：指由核糖体合成的肽链进一步经历各种变化,(,特别是各种化学反应,),以改变结构、性质、活性，甚至改变寿命,蛋白质翻译后修饰内容丰富,一级结构的修饰，例如肽键水解、侧链修饰，又有空间结构的修饰，例如肽链折叠、亚基装配,不可逆修饰，例如羟基化，又有可逆修饰，例如磷酸化与去磷酸化,不同修饰内容进行的时机或场所不尽相同，在蛋白质多肽链的合成过程中、合成完成后、靶向转运或分泌过程中、到达功能场所后、参与细胞代谢时、最终被降解时，都可能进行,一、部分切除,由蛋白酶水解特定肽键，切除信号肽、内部肽段、末端氨基酸，或者水解成一系列活性片段。这种水解是,不可逆的,。,1,、,N,端切除,原核生物甲酰蛋氨酸，真核生物蛋氨酸,膜蛋白、分泌蛋白前体信号肽,2,、蛋白激活,由蛋白酶水解实现的,例如,:,转化生长因子,、,表皮生长因子和胰岛素,二、折叠和装配,蛋白质折叠,(Protein folding),：具有不确定构象的新生肽链折叠形成具有天然构象的功能蛋白的过程,蛋白质的一级结构是其构象的基础,蛋白质多肽链能够自发折叠，形成稳定的天然构象,不过，蛋白质多肽链在体内的折叠是在辅助蛋白的协助下进行的,辅助蛋白包括,折叠酶类和蛋白伴侣,分子伴侣（,chaperone,）,1,、定义：,能与其它构象不稳定（构象松弛）的蛋白结合并使之稳定的一类蛋白质，它们通过,与多肽链结合帮助多肽,在体内的折叠、组装、转运或降解，在完成任务后从多肽上释放下来。,2,、功能：,分子伴侣是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者。,3,、蛋白质构象病,错误折叠的蛋白质能互相聚集，形成,淀粉样沉淀,而致病，这类疾病称为蛋白质构象病，盶病毒病、阿尔茨海默病,(Alzheimer disease),、帕金森病,(Parkinson disease),等,4,、蛋白质装配,在内质网上合成的许多分泌蛋白和膜蛋白都由多亚基构成。这些蛋白质的装配都在,内质网内进行,。缀合蛋白质的装配还涉及辅基化。,三、氨基酸修饰,蛋白质是用,20,种标准氨基酸合成的,目前从各种蛋白质中发现的氨基酸至少有,100,种,其中的,80,多种非标准氨基酸都是标准氨基酸翻译后修饰的产物,修饰包括：,氨基酸的磷酸化、乙酰化、酰基化、羟基化、甲基化、羧基化、核苷酸化等,四、糖基化,生物体内多数蛋白质都是缀合蛋白质,其中以糖蛋白居多,糖蛋白所含的糖基是在翻译后修饰阶段加接的，加接过程称为糖基化,(,glycosylation,),糖蛋白寡糖的功能,活性必需,靶向转运,分子识别,结构稳定,易于溶解,五、蛋白质泛素化（,ubiquitination,）,泛素：在真核生物普遍存在，是一类高度保守的,调节蛋白,泛素化：指用一个或多个泛素单体共价标记靶蛋白，从而影响其稳定性、功能、靶向转运，或被,26S,蛋白酶体识别并降解,泛素通过泛素化系统介导蛋白质降解,第六节 蛋白质的靶向转运,胞浆内各种蛋白质,游离核糖体,分泌蛋白、膜蛋白和溶酶体蛋白,内质网核糖体,靶向转运：或分选，蛋白质向功能场所转运的过程,整个转运过程可以分为两个阶段,:,蛋白质向细胞器转运，,通常在蛋白质合成过程中或合成刚结束时进行。蛋白质在该阶段分别进入内质网、线粒体或细胞核等,转运到内质网的蛋白质进一步进入分泌途径,。高尔基体蛋白、溶酶体蛋白和细胞膜蛋白都以小泡,(vesicle),形式通过分泌途径转运,一、进入内质网腔,分泌蛋白由结合在内质网膜表面的核糖体合成，并且,合成与转运是同时进行,的，即新生肽链直接进入内质网腔，该过程称为,共翻译转运,(,cotranslational,translocation),1,、信号肽（,signal peptide,）,2,、信号肽受体蛋白：,核糖体锚定于内质网膜的过程需要两个关键成分,:,信号识别颗粒,(SRP),和,SRP,受体,3,、共翻译转运过程,共翻译转运过程,合成,信号肽与,SRP,结合（,SRP,与,GTP,结合，中止新生肽链合成）,SRP-,新生肽链,-,核糖体,-mRNA,与内质网表面,SRP,受体结合,核糖体,与贯穿内质网膜的,转位子,结合（,SRP,、受体水解,GTP,解离）,转位子通道开放,，信号肽引导,新生肽链穿过进入内质网腔,内质网腔中的信号肽酶,切除信号肽,新生肽链,继续合成并进入内质网腔,新生肽链,合成完毕,，,核糖体解离,通道闭合,，新生肽链在内质网腔内折叠，形成具有天然构象的蛋白质,新生蛋白在,内质网内通过几种方式进一步修饰,，然后转运到不同场所，包括以转运小泡形式向,高尔基体转运,。蛋白质在高尔基体内进一步修饰,(,包括,O,、,N,糖基化,),，向不同场所转运，或分泌到细胞外,二、嵌入内质网膜,三、进入线粒体,线粒体蛋白大部分由染色体,DNA,编码，在细胞质内翻译合成，合成之后才向线粒体内转运，称为,翻译后转运,(Post-translational translocation),。,1,、线粒体蛋白的信号肽 在细胞质内合成的线粒体前体蛋白的,N,端,2,、线粒体蛋白的转运,前体蛋白由,分子伴侣,Hsp70,保护，呈伸展状态,(,否则不能转运,),前体蛋白与线粒体,外膜上的内运受体,结合，向,内外膜接触点,转移,前体蛋白由信号肽引导，穿过,外内膜转位子通道,Tom40,和,Tim23/Tim17,Tim44,上分子伴侣,Hsp70,与前体蛋白结合,，水解,ATP,供能促进其内运,信号肽被,信号肽酶切除,;,线粒体蛋白形成,活性构象,，多数需要线粒体伴侣蛋白协助,线粒体蛋白包括线粒体基质蛋白、内膜蛋白、外膜蛋白、膜间隙蛋白。后三类蛋白在进人线粒体基质之后还要继续转运。转运需要依靠这些蛋白质所含的其他靶向序列及相关转运系统来完成，其转运机制不尽相同,四、进入细胞核,第七节 蛋白质生物合成的抑制剂,1,、氨基糖苷类：抑制革兰阴性菌的蛋白质合成 ，链霉素 、卡他霉素、庆大霉素、阿米卡星、,G418,2,、大环内酯类：抑制葡萄球菌、链球菌等革兰阳性菌的蛋白质合成，红霉素、阿奇霉素和克拉霉素,3,、四环素和土霉素,4,、,氯霉素：广谱抗生素,5,、林可酰胺类：林可霉素和克林霉素,6,、氨基核苷类：,嘌呤霉素,，对原核生物和真核生物的蛋白质合成均有干扰作用,7,、,白喉霉素,：真核生物蛋白质合成的抑制剂,思考题,1,、,RBS,、,ORF,、遗传密码（,genetic code,）、同工,tRNA,、氨基酸负载、,S-D,序列、,Kozak,序列、分子伴侣、,NLS,2,、密码子（终止密码子、起始密码子）概念和特点。,3,、摆动假说,(,要点,),4,、核糖体,3,个,tRNA,结合位点,5,、翻译过程可分为哪几个步骤？,6,、原核生物和真核生物的蛋白质合成起始差异，原核生物,30S,起始复合体,7,、蛋白质在合成之后的各种修饰（要点）,。,8,、共翻译转运、翻译后转运,