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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十一 组织培养与病毒的细胞感染法,练习内容,1鸡胚纤维母细胞培养法（示教）,2病毒的空斑形成试验（示教）,3致细胞病变作用的观察（示教）,1,目的要求,1了解细胞培养的原理与方法,2了解病毒空斑形成试验方法与意义,3了解病毒对细胞致病变作用的类型。,2,一、单层细胞培养法,（一）鸡胚纤维母细胞培养法,（二）人胚肾细胞培养法,二、人双倍体细胞培养法,双倍体细胞株，是一种能在体外分裂50代左右而直保持其双倍染色体的单层细 胞，人双倍体细胞来源可以是人胚肺（4个月以内的胎儿）或人胚肾,3,三、传代细胞培养法,传代细胞系是一种永远在体外繁殖传代的单屋细胞。它们通常来源于癌细胞或由双 倍体细胞转化而来，实验室常用从人瘤细胞建立起来的传代细胞如,Hela,细胞，,KB,细胞、,HEP2,细胞已广泛地应用于病毒实验。这些传代细胞系的最大特点是通过规律地间 隔传代，可以无限制地传下去，如果将它们悬浮,四、器官培养,4,五、病毒的细胞感染法,在单层 细胞上测定病毒的方法有多种，常见的有病毒空斑形成试验、病毒空斑形成抑制试验.,六、细胞致病作用的观察,细胞致病作用也称“细胞病变作用” （,Cytopathic-effect，CPE），,根据病毒和感染细胞的不同，细胞病变作用大致上可以分不同三个类型。,5,（一）全变型,指整个细胞都发生改变，常表现为（1）细胞核及整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变性、胞膜边缘不整齐，或（2）整个细胞发生碎裂、皱缩、变圆、脱落。,（二）包涵体型,有的病毒可在胞核或胞浆内形成包涵体（见表133）。,（三）融合型,有的病毒（如麻疹病毒、单纯庖疹病毒等）可使多数病变细胞间相互发生融合而呈 “巨细胞”（但各个细胞的胞核仍可分辨）。,6,【结果观察】,纵观整个单层细胞，以下列符号表示其病变程度：,（） 无细胞病变；,（+） 25以下的细胞有病变作用；,（+） 一50的细胞有病变作用；,（+） 一75左右的细胞有病变作用；,（+） 一75以上的细胞有病变作用；,7,某些病毒引起细胞病变的主要特征(表132 ),8,实验十四 病毒的血清学试验,血清学试验的方法很多，一股实验室最常用的是中和试验，补体结合试验和红细胞 凝集及凝集抑制试验。近年来免疫荧光技术、免疫酶联吸附技术、间接红细胞凝集试验、 琼脂扩散试验以及红细胞吸附抑制试验等技术，也成为实验室病毒诊断的常规技术。,9,练习内容,1病毒的血球凝集试验,2病毒的血球撬集抑制试验,10,目的要求,1了解病毒的血清学试验方法与原理,2掌握病毒的血凝试验和血抑试验的方法与结果判读,血清学试验是实验室诊断病毒和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的基本方法之一。,11,三、病毒的血球凝集与血球凝集抑制试验,某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，见表玉14一4。当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了与红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约、并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点 .这里我们以新鸡城瘟病毒,NDV,为例介绍血凝和血凝抑制试验。,12,【材料】,新城鸡瘟病毒鸡胚接种尿囊液 1份,0.5鸡血球悬液 1管,生理盐水或,PBS 1,瓶,96孔微量血清盘 1块,微量稀释棒 1支,无菌试管 1支,13,【方法】,1在微量血清盘的末孔标记为对照孔。,2各孔中加生理盐水25微升。,3取病毒鸡胚尿囊液（经离心）0.1毫升加入无菌试管，然后加生理盐水0.9毫升（即110稀释）。,4取110病毒稀释液25微升加入第1孔，再吸25微升置2孔，用微量稀释棒捻转20次依次稀释，直至第9孔弃去25微升。,5各孔中加0.5鸡红血球25微升充分摇匀。,6置室温经30分钟，40分钟，1小时各观察一次结果。以45分钟为准。,14,新城鸡瘟病毒血凝试验操作顺序(表14-5 ),15,25,25,25,25,25,25,25,25,孔 列,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,病毒稀,释度,110,120,140,180,1160,1320,1640,11280,12560,对照,生理盐水（,l）,25,25,110病毒悬液（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,弃去25,0.5%鸡红血球（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,25,摇匀后，置室温静止3050分钟,16,【结果判读】,各孔出现的血球凝集程度以+、+、+、+、+、表示。,+为全部血球发生凝集，呈颗粒状薄膜铺于孔底；,+约有50血球发生凝集；,+约有50血球发生凝集；,+约有25血球发生凝集；,不凝集，表现为血球沉于孔底，呈一致密小点，边缘光滑，圆润。,血凝试验的结果以50血球凝集（+）的最高病毒稀释度为试验的血凝滴度，即为1个血凝单位。,17,血球凝集抑制试验,【材料】,除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。,18,【方法】,1血凝素单位的配制和调配,2住微量血清盘上编号，并设血清对照、病毒（血凝集）对照和血球对照孔然后211孔中各加生理盐水或,PBS25,微升。 ,3将110血清加入1、2、9孔，并从第2孔起作一系列倍比稀释至11280或更高的稀释度，每孔为25微升。,4按操作简表加入4单位血凝集。,19,6混匀，在室温下作用20分钟。,7各孔中滴加0.596鸡血血球悬液50微升。,8在血清对照、病毒（血凝素）对照，血球对照孔中滴加生理盐水或,PBS,各25微 升。,9混匀后，在室温下静止，30分钟，60分钟各观察一次结果。一般以60分钟结果为准，但如果血球下滑显著，则以30分钟结果判读。,20,25,25,25,25,25,25,25,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,血清稀,释度,110,120,140,180,1160,1320,1640,11280,血清,对照,病毒,对照,血球对照,生理盐水（,l）,NS,25,50,稀释的血清（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,弃去,4单位血凝（,l）,25,25,25,25,25,25,25,25,25,摇匀后，置室温静止3050分钟,0.5%鸡红,血球（,l）,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,21,1根据各孔血球凝集程度，以“+、+、+、+，”表示。,2查看各对照孔：血清对照不凝集（）：病毒对照为完全凝集（+），血球对照则应不凝集（）。,3以出现完全抑制血球凝集（即不凝集）的最高血清稀释度为其最终滴度。例如,稀释倍数：110,l20 140 l80 1160 1320 l640 11280,结,果： , ,+ + +,此血清血凝抑制滴度为1160，结果判读】,22,实验十五 病毒的快速诊断,目的要求,1初步掌握电镜下病毒的基本形态,2了解,ELISA,的原理、方法及结果判读,23,练习,ELISA,24,酶联免疫吸附试验,（,Enzyme Linked immunosorbent assay， ELISA）,ELISA,是当前各实验检测抗原抗体最常用的方法之一，也是进行病毒快速诊断的重要手段。它具有灵敏度高（10,9,一10,12,克），特异性强、操作简便、易于观察、便于现场大规模检查。,25,ELISA的种类有许多种，但用于病毒快速诊断常用间接法和双抗体夹心法,26,（一）间接法（indirect method）,1抗原包被 纯化抗原用,pH9.6,碳酸盐缓冲液适当稀释后，在微量凹孔板上，每孔加100微升，置湿盒中4过液，洗涤三次。,2加待捡血清 每孔加100微升适当稀释的待检血清，置湿盒中，372小时。洗涤三次。,3加酶结合物 每孔加100微升酶标记抗人,Ig，,置湿盒中，372小时。洗涤三次。,4加底物 每孔加底物100微升，置湿盒，3730分钟。,6加终止液100微升。,6读取结果。,27,（二）双抗体夹心法（Double antibody sandwich method）,1抗体包被 已知抗体用,pH9.6,碳酸盐缓冲液稀释至110微克毫升，在微量凹孔板上，每孔加100微升包被，置湿盒4过夜。洗涤三次。,2加待检标本 每孔中加含抗原的待检标本100微升置湿盒37小时。洗涤三次。,3加酶结合物 每孔加酶标记的特异性抗体100微升置湿盒37小时。洗涤三次。,4加底物,5加终止液,6读取结果,28,【结果判读】,用酶标测定仪测在492,nm,下各标本光密度,OD,值。,ELISA,的结果易受到各种因素影响，因此每次试验（每一块试验板）都设阳性对照，阴性对照、稀释液对照、阳性对照,OD,值1.0，阴性对照,OD,值0.2，结果用,PN,值表示。,P/N,值1.5-2.1者为可疑,PN,值1.5为阴性,PN,值2.1者为阳性,29,
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