微生物遗传-结合转移

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,细菌质粒的接合转移, 三亲本杂交,微生物遗传学实验,1,实验原理：1、质粒的转移性,细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。,接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程。,质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整的编码转移酶的,tra,基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌的 F 质粒。,有些质粒不含,tra,基因,但含有质粒转移起始位点,oriT，,虽不能自主转移，但能被其他一些含完整,tra,基因的质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。,2,3,实验原理：2、本实验所用供体质粒,本实验中要转移的质粒是pHN102，它是在广宿主范围的稳定载体pTR102,中插入,生物发光酶基因luxAB,构建而成。,pTR102中带有含,par,基因的稳定性片段（stabillty）,它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点,oriT，,不含完整的转移基因,tra,，必须在含有,tra,基因的辅助菌株诱动下， pTR102,才能从供体菌向受体菌转移。,为有效筛选转移接合子,(transconjugant), pHN102,质粒上带有 Tc 抗性和生物,发光酶基因(,lux,AB）两个,标记。加入,lux,AB的底物癸醛,（Decanal）后，菌体可发出,微弱荧光。,4,实验原理：3、三亲本杂交,本实验中的辅助菌株是,E. coli,(pPK2073）,，,pPK2073中带完整的,tra 基因，,将已活化的供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中的质粒（ pHN102,）可以在协助菌的帮助下通过接合转移方式导入受体菌（,费氏中华根瘤菌,Sinorhizobium fredii,）中。因此该接合转移过程称为三亲本杂交。,实验菌株,供体菌：,E.coli,DH5(pTR102-luxAB) (Tc,R,、,lux,AB),受体菌:,Sinorhizobium fredii,( Tc,S,),辅助菌:,E. coli,MM294 (pRK2073)（Spec,R,）,实验产物,转移接合子:,S. fredii,(pTR102-luxAB), (Tc,R,，,lux,AB),5,实验准备,菌株活化,（教师做）：,将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：,E. coli,(pTR102-luxAB): 液体LB + Tc 20g/ml, 37,O,C震荡培养1夜；,S. fredii,: TY液体, 28,O,C震荡培养2天 ；,E. coli,(pPK2073) : 液体LB + Spe 50g/ml ,37,O,C震荡培养1夜,倒平板,（学生做）：,第1、2组：倒不加Tc的SM（平皿上标记“纯SM” ）：,融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4,O,C）备用。,第3、4组：倒TY平板：,融化1瓶TY固体, 倒平板12-13个, 凝固后分发到4个超净台使用。,第5、6组：倒SMTc平板（平皿上标记“SMTc” ） ：,融化SM后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml （Tc,10mg/ml,装在1.5ml离心管中，标记“Tc” ），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4,O,C) 备用。,6,操作步骤：三菌混合培养（第1天）,(1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min 离心1分钟。,(2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。,(3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200l的 tip 抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）,(4) 加好菌液后，静置510分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28,O,C培养1天。,7,操作步骤：,洗菌涂平板（第2天）,（1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人), 镊子揭下TY平板上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。,（2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,混匀。,（3）吸已稀释的菌液分别涂布于昨日倒的 SM+Tc 平板和不加 Tc的纯SM上（每个同学各涂1板， 200l / 板）,（4）放28,O,C培养6-7天，下周看结果：,在暗室内向培养皿中加10,L癸醛，35分钟后即可看到转移接合子的,luxAB,基因发出的微弱荧光,SM+Tc平板的单菌落数,质粒转移频率,纯SM平板的单菌落数,8,