(第九章)第十章体细胞无性系变异及突变体筛选

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第十章,体细胞无性系变异及突变体筛选,授课老师,：,韦鹏霄,第十章,体细胞无性系变异及突变体筛选,第一节,体细胞无性系变异,第二节,植物细胞突变体的筛选,第一节,体细胞无性系变异,一,、体细胞无性系变异的定义,二,、体细胞无性系变异的普遍性,三、,体细胞无性变异的表现及类型,四,、体细胞无性系变异的频率,五,、体细胞无性系变异的机理,六,、体细胞无性系变异的特点,七,、影响体细胞无性系变异的因素,八,、体细胞无性系变异在育种上的应用,九,、体细胞无性系变异的几个实例,第一节,体细胞无性系变异,一、,体细胞无性系变异,的,定义,体细胞无性系变异,（,Somaclonal variation,）（我们在第一章第二节“植物细胞工程常用术语”中曾叙述到）,指,在组织培养过程中,，,来自,体细胞,的培养物及再生植株发生的,变异,。,此句里面还有,2,层,意思,：,第一层,意思,是这一,变异,来自,组织培养,，以区别于一般所指的,自然变异,、,遗传变异,和,理化诱变,；,第二层,意思,是这一,变异,发生在,体细胞,，而不是,性细胞,，以区别于,花药（花粉）培养,。,这一,定义,最早来自,Larkin,（拉金）和,Swwcroftl,（斯考史罗夫特）（,1981,），以后，,Evanz,（埃文斯）（,1984,）、,Larkin,（,1985,）和,朱自清,（,1991,）等对此作过评述。,1990,年又出版了,Bajai,（巴扎）主编的有关体细胞无性系变异的专著。,体细胞无性系变异,有,遗传性,的和,生理性,的，,遗传性的,变异,主要为基因和染色体发生的变异，可代代遗传；,生理性的,变异,主要是由于环境条件的改变，使组织或细胞的某些生理功能发生变化，一般不能遗传。（在多种植物出现同种变异，在同种植物出现多种变异）,第一节,体细胞无性系变异,二、,体细胞无性系变异,的,普遍性,大量资料表明，,体细胞无性系变异,是,植物组织培养过程中出现的普遍现象,。已经观察到,体细胞无性系变异,的,农作物,有：,甘蔗,（,Heinz,et al, 1971,）、,马铃薯,（,Oono,1987,）、,小麦,（,Larkin,et al,1984,）,玉米,（,Peschke,etal,1987,）,燕麦,（,Cummings etal,1976,）,大麦,（,Deambrogio,1980,）,小黑麦,（,Nakamura,etal,，,1982,）、,谷子,（赵连元等，私人通信）、,油菜,（,Hoffmann,etal.,1982,）、,大豆,（,Freytag,etal.,1981,）、,兰花,（魏亚鉥 ，,1992,）、,蕃茄,、,茄子,、,瓜类,，,甜菜,、,菊苣,、,烟草,、,草莓,、,桃,、,天竺葵,、,倒挂金钟,、,香石竹,、,水晶掌,和,锦带花,等（,Bajaj,1990,）。,1971,年，,Heinz,（海因茨）和,Mee,（,米）报道,甘蔗,再生植株中存在广泛的变异，包括形态学、细胞遗传学和同工酶谱。,其中,观赏植物,的,无性系变异,可利用性很广泛，是值得注意的新动向。,组织培养中的这种,体细胞无性系变异,既不限于某种物种，也不局限于某些器官。变异所涉及的性状也相当广泛。,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,体细胞无性系变异,主要表现在以下几个方面：（或分为几种类型）,1,、植株,外部形态,的变异,2,、,育性上,的变异,3,、,生长势,上的变异,4,、,抗性,变异,5,、某些,酶,或,同工酶,发生差异,6,、,次生代谢物,的差异,7,、,染色体,结构,或,数量,上的变异,8,、某些,基因组,DNA,的变异,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,1,、植株,外部形态,的,变异,（,1,）,株高,：高于或矮于原供体植株，如水稻、小麦，烟草等；,（,2,）,叶形,：,1,）大于或小于原供体植株；,2,）形状不同于原供体植株，如烟草；,（,3,）,叶色,：,1,）有叶片条纹，如燕麦；,2,）叶片缺绿（白化苗），如玉米,（,4,）,茎色,：茎有条纹，如甘蔗，茎有黄色条纹（呈黄绿相间），像一种竹（斑竹）。,（,5,）,穗型,：,1,）大于或小于原供体植株；,2,）密于或疏于原供体植株。,（,6,）,粒型,：,1,）大于或小于原供体植株；,2,）大于或短于原供体植株。,（,7,）,粒色,：不同于原供体植株。,（,8,）,芒性,：,1,）芒有无；,2,）芒长短。,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,2,、,育性,上的,变异,变异表现为全不育或半不育，如水稻、番茄等。,3,、,生长势,上的,变异,（,1,）,抽穗期,：早于或迟于原供体植株，如水稻，玉米。,（,2,）,花期,：早于或迟于原供体植株,（,3,）,成熟期,：早于或迟于原供体植株,（,4,）,杂种优势,：生长势强于原供体植株，如玉米。,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,4,、,抗性,变异,（,1,）,抗病性,：强于原供体植株。,抗,玉米,小斑病毒；,抗,甘蔗,斐济病毒，霜病毒；,抗,水稻,白叶枯病；,抗,马铃薯,晚疫病、枯萎病。,（,2,）,抗代谢物,：,（,3,）,抗铝毒性,：如水稻（国际水稻研究所，,Swwcroft,1986,）,（,4,）,耐盐性,：比原供体植株耐盐。,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,5,、某些,酶,或,同工酶,发生,差异,（,1,）,淀粉酶,，如小麦,（,2,）,酯酶,同工酶，如甘蔗,6,、,次生代谢物,的,差异,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,7,、,染色体,结构,或,数量,上的,变异,（,1,）,染色体,结构,：,1,）,染色体桥,：如胡萝卜、单冠毛菊、烟草等,2,）,染色体,X,、,2X,、,3X,、,4X,、,8X,3,）,落后染色体,：如柳杉,（,2,）,染色体,数量,：,1,）,非整倍体,：如柳杉、常春藤、龙葵、小麦等；,2,）,多倍体,：如五针松、西藏长叶松、烟草、大麦等；,3,）,混倍体,：如玉米、茄子等。,第一节,体细胞无性系变异,三、,体细胞无性变异,的,表现,及,类型,8,、某些,基因组,DNA,的,变异,（,1,）,核,基因,突变,：,单基因,突变（隐性或显性）；,多基因,突变。,（,2,）,细胞质,基因,突变,：,线粒体,基因变异；,细胞质,雄性不育,基因,突变,，不育可育,第一节,体细胞无性系变异,四,、,体细胞无性系变异,的,频率,体细胞无性系变异,的,频率,在一些作物上是非常高的，可达,10%,以上。,表,14-4,：一些植物的体细胞无性系变异（表型）出现的频率,植物种,再生植株来源,表型变异频度（,%,）,研究者,菠萝,幼果愈伤组织,100,Wakasa(1979),裔芽愈伤组织,98,Wakasa(1979),腋芽愈伤组织,34,Wakasa(1979),冠芽愈伤组织,7,Wakasa(1979),烟草,体细胞愈伤组织,10,Popchristov,和,Zaganska(1977),水稻,胚愈伤组织,71.9,Oono(1978),幼穗愈伤组织,97.3,赵成章等（,1982,）,甘蔗,幼叶愈伤组织,18,Heinz(1971,1976),马铃薯,幼叶愈伤组织,100,Shepard(1980),玉米,体细胞愈伤组织,14,Green(1977),表,14-4,：一些植物的体细胞无性系变异（表型）出现的频率,第一节,体细胞无性系变异,五,、,体细胞无性系变异,的,机理,对,体细胞无性变异,现象，由于是在上世纪七十年代末期才开始系统研究，所以迄今对其起因尚未完全清楚。,总的来说不外乎,两方面,的,原因,：,一,是,供体组织,的,细胞,中原已发生,变异,，当它们再生成完整植株时，这种变异便表现出来。但对这种看法目前尚无足够的实验证据。,二,是组织培养循环过程,诱导培养,的,细胞,产生,变异,，这点已为许多试验所证实。,第一节,体细胞无性系变异,六,、,体细胞无性系变异,的,特点,主要有,4,点,：,1,、变异广泛：,2,、后代稳定性：,3,、能基本保持原品种特性,4,、潜在隐性性状活化,第一节,体细胞无性系变异,六,、,体细胞无性系变异,的,特点,1,、,变异,广泛,：,如前所述，植物,体细胞无性系变异,现象相当普遍，变异所涉及到的性状也相当广泛，包括,数量性状,和,质量性状,的变化，,染色体,数目,和,结构,的变化、,DNA,扩增或减少，,生化特性,的变化等。,2,、,后代,稳定性,：,虽然,体细胞无性系,再生植物的绝大部分性状变异是生理效应，不能遗传，但也有,少数,性状,变异,是可以,遗传,的，如,水稻,的粒型、丛生型、抗病性等。这些可遗传的变异通常在再生植株二代便可稳定下来，成为,稳定,株系,。但也有部分株系是,杂合体,继续产生分离。不过这种分离多属,简单,分离,，分离的程度与供体植株的遗传背景有关，一般,小麦,稳定株系为,3050%,，,水稻,为,90%,左右。,第一节,体细胞无性系变异,六,、,体细胞无性系变异,的,特点,3,、能,基本,保持,原,品种,特性,因为,体细胞无性系变异,大部为,单一性状,变异,，做能基本保持原品种的特性。,4,、潜在,隐性,性状,活化,在,体细胞无性系后代,中，常见一些原供体植株所没有的,隐性性状,变异,，象雄性不育性、矮杆、叶绿体突变等，有些隐性特性对育种实践具有重大利用价值。,由于,体细胞无性系变异,具有上述,4,个特点，因此，在育种上的应用日益受到重视。,第一节,体细胞无性系变异,七,、影响,体细胞无性系变异,的,因素,影响,体细胞无性系变异频率,的,因素,很多，主要有：,1,、植物的,繁殖类型,：,2,、,外植体,的来源部位：,3,、植物,再生,的,方式,：,4,、,继代培养,次数和培养时间：,5,、,生长调节剂,浓度的影响：,第一节,体细胞无性系变异,七,、影响,体细胞无性系变异,的,因素,1,、植物的,繁殖类型,：,一般认为长期,营养繁殖,的植物,变异率,较高,，有人认为这是由于,外植体,的,体细胞,中已积累着遗传差异。自然条件下，如一些,果树,的,芽变,（在无性繁殖、扦插、嫁接等）。,2,、,外植体,的来源部位：,不同来源部位的,外植体,，,无性系变异频率,有较大的差异。如,菠萝,，来源于,顶芽,组织（冠芽）的较低，而其它来源的较高。,3,、植物,再生,的,方式,：,通过,愈伤组织分化不定芽,的方式再生的植株,变异多,，通过,胚状体途径再生的植株,变异较少,。通过,茎尖,或,分生组织,培养增殖,侧芽,，可以保持基因型基本不变。,第一节,体细胞无性系变异,七,、影响,体细胞无性系变异,的,因素,4,、,继代培养,次数,和,培养,时间,：,随着,愈伤组织,继代培养,次数,和,培养,时间,的增加，变异率不断增高，（实为激素累积影响，“,激素,累积效应,”）年龄幼小的培养物再生的植株变异率低，年龄偏老的培养物再生的植物变异率较高。,5,、,生长调节剂,浓度,的影响：,在高浓度生长调节剂作用下，细胞分裂和生长均加快，但不正常分裂频率增高，再生植株的变异也增多。,第一节,体细胞无性系变异,八,、,体细胞无性系变异,在,育种上,的应用,体细胞无性系变异,在育种上应用的时间虽然不长（从,1971,年开始系统研究,甘蔗,无性系,算起，这方面工作仅有,20,多年历史），但一些育种学家已利用它有效地进行品种改良，并已育出一些新品种。,如,台湾,从,甘蔗,再生植株中选育,高糖量的品种,；,中,国,水稻研究所（赵成章）从,水稻,无性系,中选出,高产新品种,；,美国,的,DNA,植物技术研究所从,番茄,无性系,中选出了新品种；,Shepard,等和,Matern,等也分别从,马铃薯,原生质体细胞系,中选育出了一些新的高产或抗病新类型，等等。,第一节,体细胞无性系变异,八、,体细胞无性系变异,在,育种上,的应用,利用,体细胞无性系变异,育种,有如下主要,优点,：（,6,点）,、,变异率,较高,；,（前已讲，高于自发变异和理化诱变）,如,水稻，,经,组培,获得的,突变率,可达,16.7%,，经,理,、,化,处理的诱变率一般为,78%,，比高,2,倍。,2,、致死和半致死,突变率,低于,常规,诱发突变,；,用常规物理诱变，如,CO,60,照射，致死和半致死突变率较高,3,、,单基因,变异,频率高,；,利用此种变异可改变作物的个别性状而不使其它优良性状发生重组及分离。,4,、可在,试管中,筛选特定的,变异体,；,5,、如采用,单倍体,细胞,作为,培养物,，,隐性,变异,可在,当代,（,Ro,）表现，利于选择；,6,、,育种周期,较短。,第一节,体细胞无性系变异,八、,体细胞无性系变异,在,育种上,的应用,体细胞无性系变异,用于,育种,的,主要程序,（,2,种）,待改良的品,种,组织或细胞,培养物变异,R,0,R,1,群体,选择（决选）,改良了的无性系,性状稳定性评价,田间试验,多点试验,区域试验,品系,新品种,测定变异的遗传基础,回交,图： 孢子体体细胞,二倍体,无性系变异选育品种程序,再 次 组 织 培 养,待改良的品种,单倍体花粉愈伤组织,单倍体植株,纯合二倍体植株（,H1,）,人工加倍,变异,花药（粉）培养,H2,选择变异株,H3,选择变异株或株系,H4,测定变异的遗传基础,品系,多点试验,回交,稳定性评价,区域试验,品种,二倍体愈伤组织,杂合二倍体植株（,H1,）,变异,变异前自,然加倍,二倍体愈伤组织,变异后自然加倍,图：配子体（花粉）细胞无性系变异选育品种程序,第一节,体细胞无性系变异,九,、,体细胞无性系变异,的几个,实例,（一）,水稻,：,1,、,Oono,（,1981,）种胚愈伤组织再生植株变异后代,2,、赵成章等（,1982,），幼穗再生植株高产、抗病（白叶枯病）,（二）,麦类,：,1,、,Larkin,和,Scowcroft(1984),未成熟胚再生植株,（三）,玉米,：,（四）,其它作物,：,1,、甘蔗：,2,、烟草：,3,、五针松：,第二节,植物细胞突变体的筛选,一,、,细胞突变体,的有关,概念,二,、植物,细胞突变体,筛选,的发展由来,三,、利用培养的,细胞诱变,与,筛选,突变体,的,优,缺点,四,、离体培养,细胞突变,的,判断,标准,和,分类,五,、,细胞突变体,的诱发和,筛选,第二节,植物细胞突变体的筛选,一,、,细胞突变体,的有关,概念,1,、,突变,（,mutation,）,指的是遗传物质（,DNA,）一级结构上发生的一种永久而能遗传的变化，这种变化在有性繁殖时可传给后代，在无性繁殖时，可在细胞中测出变化了的基因产物。,2,、,突变体,（,mutant,）：,指具有某一突变基因，从而表现某一表型的细胞或个体称之。,（另意：变异的表型能有性传递给后代，此表型称之。）,3,、,变异体,（,Variant,）：,指在表型变化的原因（突变或后成遗传）未明之前的变异细胞或个体称之。,第二节,植物细胞突变体的筛选,一,、,细胞突变体,的有关,概念,4,、,突变体,筛选,指用分子生物学的知识，微生物学的研究方法，以植物细胞作为实验体系，大量筛选拟定目标的突变体，来改变植物遗传性状的一种方法。也就是说把植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上，用生物化学的方法，从细胞水平上大量筛选似定目标的突变体。,第二节,植物细胞突变体的筛选,二,、植物,细胞突变体,筛选,的发展由来,以,细胞,培养物,作为操作对象进行,突变体,筛选,研究是和,组织培养技术,的发展密切关联的。,上世纪五十年代末期，揭示,植物细胞全能性,的技术完成后，使,突变体,的,筛选,工作可以在,细胞,水平上进行。以培养,细胞,进行,突变体,筛选,研究工作始于,1964,年，由,Tulecke(,培莱克,),首先从,银杏,花粉,培养物中分离出需要,精氨酸,的,细胞,突变体,。,1970,年，,Carlson,（卡尔森）、,Heimer,（海曼）和,Binding,（宾迪）等人分别从,烟草,和,矮牵牛,的细胞中分离出几种,营养缺陷型,细胞,及,抗苏氨酸,和,抗链霉素,的,细胞,突变体,，才逐渐拉开了筛选和利用细胞突变体研究之惟幕。,第二节,植物细胞突变体的筛选,二,、植物,细胞突变体,筛选,的发展由来,此后二十余年来，不断报道了具有各种明确目的性的,细胞突变体,的,筛选,研究，主要是各种,抗性,细胞突变体,的,筛选,，如,抗病,、,抗除草剂,、,抗,（,盐碱,、,酸壤,、,重金属离子,、,干旱,、,低温,等）逆境的各种,细胞突变体,、,营养缺陷型,以及为提高细胞,氨基酸,的含量而进行,抗氨基酸,及其类似物的,细胞突变体,的筛选等等。,至,80,年代，由于对筛选技术及表型变异传递规律和机理均有较深入的研究。因此，,细胞突变体,的研究获得几百个抗性变异株，分别属于,14,个科的,44,个种选择出来的,211,种表型（表,14-5,），其中各个种总共,90,个变异系表型能再生植株。,第二节,植物细胞突变体的筛选,二,、植物,细胞突变体,筛选,的发展由来,可以认为，高等植物,细胞突变体,的筛选与利用的研究，是,离体培养技术,高度发展与,细胞工程,和,分子遗传学,高度结合的产物，是植物生物工程中创建新种质资源的一个组成部分。,第二节,植物细胞突变体的筛选,三,、利用培养的,细胞,诱变,与,筛选,突变体,的,优,缺点,1,、,优越性,：（,3,点）,（,1,）,该系统提供大量可供选择各种变异类型的群体，筛选方便,。,例如,，在一个培养皿中可以也容易培养与处理,510,5,个细胞并从中筛选突变体，倘若在大田中种植相同数量的植株则需要,0.6,公顷的土地。（,Scoworoft,1978,）,（,2,）,诱变效率高，筛选的时间短,。用植物细胞，特别是单倍体细胞，在细胞水平上直接诱发与筛选植物细胞突然袭击变体，不仅能应用微生物诱变与筛选的技术快速获得突变体，还能防止与限制形成嵌合体。有时可达到几乎是同质的水平。,第二节,植物细胞突变体的筛选,三,、利用培养的,细胞,诱变,与,筛选,突变体,的,优,缺点,例如,，,WEBER,和,Lark(1979),仅,7,天就从,大豆,培养细胞中筛选出,抗,8-,氮鸟嘌呤,的,突变体,，而且从单倍体细胞还能较容易地筛选出隐性的突变。,（,3,）,整体植物各种突变体是以观察可见特征为手段而鉴别,。,当,突变,是某些特异性无化功能改变时，一般不能进行有目的选择，因此在植株水平上研究突变的分子基础难以实现，只有在培养的细胞中选择,突变体,才有利于研究突变的分子基础。还可以从,细胞突变体,的细胞学与生物化学变化一直研究到再生植株性状的遗传与变异。,第二节,植物细胞突变体的筛选,三,、利用培养的,细胞,诱变,与,筛选,突变体,的,优,缺点,2,、,不利处,：（,3,点）,（,1,）在,细胞水平,上筛选的,突变,不一定都能在,植物水平,上表达；,（,2,）与,微生物,相比，,植物细胞群体,增殖速率慢得多，需时长；,（,3,）除,原生质体,和,花粉粒,外，难以得到完全是,单细胞,的材料。,可以认为，高等植物,细胞突变体,的筛选与利用之研究，是离体培养技术高度发展与细胞工程和分子遗传学高度结合的产物，是植物生物工程中创建新种质资源的一个组成部分。,第二节,植物细胞突变体的筛选,四,、离体培养,细胞突变体,的判断,标准,和,分类,筛选出来的变异是能,遗传的变异,，抑或是性状不稳定的,后生改变,（,epigenetix changes,），这是突变性筛选方面必须搞清楚的问题。,1,、,判断,标准,：,以,Widholm(1977),和,Maliga(1976),提出的判断标准综合为,4,点：,（,1,）,遗传,方式,：变异性状能通过再生植株有性传递给后代，这是突变最有力的证据。通常,核,DNA,突变会产生,孟德尔式分离,，而,叶绿体,和,线粒体,DNA,的突变则是,母体遗传方式,。,第二节,植物细胞突变体的筛选,四,、离体培养,细胞突变体,的判断,标准,和,分类,（,2,）,变异,的,频率,：,突变,的,频率,一般都低于,10,-5,（多位点的突变除外）。,（,3,）培养,细胞,在离开,选择剂,后的,稳定性,：,在无选择压力的培养基上继代培养,23,代后原有变异仍不消失者，否则不是突变。,（,4,）具有与,基因产物,改变密切相关的,生化机理,：,例如,：通过一种,酶,的,氨基酸,顺序的改变，或是一种氨基酸生物合成控制酶改变了对有关氨基酸类似物的,反馈,敏感性,等等，均可作为,基因突变,的证明。,第二节,植物细胞突变体的筛选,四,、离体培养,细胞突变体,的判断,标准,和,分类,2,、,分类,标准,：,（,1,）,Jacobs,等（,1987,）根据,生化,和,遗传基础,以及在,农业上,的应用价值，对,细胞培养,获得,突变体,进行,分类,（表,14-6,，）,标 准,观 察 到 的 类 型,生化损伤,代谢酶活力降低成失活,酶调节性质的改变,酶活力提高,核糖体的蛋白质改变,新蛋白质合成,遗传基础,核的变化,基因突变（显隐性的；单、二或多基因的,基因扩增,转位活动,染色体重排,细胞质的变化,细胞器基因组改变,有农业价值,的改变性状,营养质量,抗胁（温度、干旱、水涝、盐、有毒金属和污染物、除草剂、病原体和害虫）,碳的有效利用,营养物的有效摄取和利用,表 培养细胞突变体分类标准（引自,Jacobs,等，,1987,）,第二节,植物细胞突变体的筛选,四,、离体培养,细胞突变体,的判断,标准,和,分类,（,2,）,缪树华,（,1990,）根据分离,突变体,的,程序,（或,方法,）对突变体进行,分类,（表,14-7,）,按分离突变体的程序（或方法）对突变体的分类（引自缪树华，,1990,）,抗性,突变体,氨基酸,和,氨基酸类似物,抗性突变体,除草剂,抗性突变体,盐,或不同,金属离子,抗性突变体,植物,病毒素,抗性突变体,抗菌素,抗性突变体,氯酸盐,和,烯丙醇,抗性突变体,抗,激素,、,冷冻,和,紫外光,抑制作用的突变体,抗,嘌呤,和,嘧啶,类似物的突变体,条件致死,突变体,营养,突变体,需要,含氮碱基,的突变体,氨基酸,营养缺陷型,需要,维生素,和其它,生长因子,的营养突变体,温度,敏感和不能利用某种,糖,作唯一碳源的突变体,表 按分离突变体的程序（或方法）对突变体的分类,（引自缪树华，,1990,）,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（一）,细胞突变体,的诱发和筛选的,基本程序,1,、预处理（制备单细胞）,2,、预培养,3,、反馈诱发突变,4,、高抗、高产细胞株的选择,5,、细胞增殖与器官建成,6,、突变株系的鉴定和遗传分析,预处理,预培养,（悬浮或平板培养）,反馈诱发突变,（平板培养）,高抗高产细胞株,选择（平板培养）,愈伤组织增殖,或再生植株,突变株鉴定,（,1,）材料选择：单细胞、原生质体、愈伤组织,（,2,）预处理：筛选诱变剂、浓度和预处理时间,（,1,）方式：平板培养或悬浮培养,（,2,）细胞密度因作物而定,（,3,）预培养时间,2,周，恢复细胞活力,（,1,）采用平板法,（,2,）加入选择因子反复培养数代,（,3,）脱除选择因子培养（一、两代）,（,1,）加入选择因子再培养数周,（,2,）按目的（品质、抗性、高产）测定进行选择,（,1,）采用花粉培养需染色体加倍（,0.2%0.4%,秋水仙素）,（,2,）原生质体需胞壁再生,（,3,）调节培养基成分采用固体培养,（,1,）初步鉴定：细胞学和分子生物学鉴定,（,2,）植株进行抗性测定和遗传分析,图： 植物细胞突变体诱发和筛选程序示意图,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（一）,细胞突变体,的诱发和筛选的,基本程序,1,、,预处理,（,制备单细胞,）,（,1,）,材料选择,：用于突变体筛选的最理想的材料为,单细胞,，或,原生质体,。也可用,茎尖,、,腋芽,等，但容易诱发嵌合体。但由单细胞成原生质体再生成植株的植物种类仅限于少数，因而在广泛使用上受到限制。,为此目前用得最多的材料是,愈伤组织,。因为：,愈伤组织,介于单细胞和具有一定结构的组织之间的组织；,愈伤组织,是分生细胞容易诱发突变。,愈伤组织,分散性好，借助酶处理分散性更好。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（,2,）,预处理,：采用,诱变剂,进行,化学诱变,处理，根据植物种类需对诱变剂的浓度、时间进行筛选，选用最适浓度、最适处理时间方可收到良好的效果。,例如,：,烟草,高蛋氨酸,突变体,筛选，以,EMS,（甲基磺酸乙酯）为诱变剂，浓度为,0.25%,，预处理时间为,1h,；,水稻,高赖氨酸,突变体,筛选以,EMS,为诱变剂，浓度为,1%,，预处理时间为,1h,。,（,3,）,制备,细胞悬浮液,：经预处理的材料用糖液洗净备用。如材料是,愈伤组织,，需借取,酶,处理。同样经过过滤、离心沉降，最后获得纯净的细胞悬浮液。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,2,、,预培养,单细胞,或,愈伤组织,经,诱变剂,处理和,酶,处理后活力下降，为恢复细胞活力必须进行预培养。,预培养,可采用,平板培养法,，亦可采用,悬浮培养法,，无法哪种方法均需考虑,细胞,起始密度,。,预培养,时间,因植物种类而异。,烟草,平板培养法,，预培养,2,周。,水稻,悬浮培养法,，预培养,10 d,。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,3,、,反馈诱发突变,诱发突变,一般采用,平板培养法,，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变，反复饲喂需数月时间。,4,、,高抗、高产细胞株的选择,将在具有,选择因子,的,培养基,中培养数月的,细胞,团，转入不加选择因子的培养基中培养，脱除选择因子。经数周后再转入具有选择因子的培养基上，培养数周后选择能旺盛分裂的细胞团（细胞株），说明该,细胞团,具有抗某种选择因子的,突变,细胞株,。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,5,、,细胞,增殖,与,器官,建成,如果采用的材料是,单倍体,细胞,，则可在分化培养基中，加入,秋水仙素,，诱发染色体加倍。分化出来的植株是正常可育,二倍体,。如果采用的材料是,原生质体,，尚需按原生质体培养程序，诱导细胞壁再生，然后器官分化，植株再生。如果采用的是体细胞,愈伤组织,，则按正常的方法诱导愈伤组织分化，植株再生。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,6,、,突变株系,的,鉴定,和,遗传,分析,（,1,）根据诱发,突变目标,进行,生化分析,（,2,）,细胞学,观察,（,3,）,性状分析,（田间性状观察）,分析,突变,是属于,遗传的,变异,（基因突变），还是属于,非遗传的,变异,（表型变异）。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（二）,诱变剂,及其作用,1,、常用的,诱变剂,种类,因,诱发,突变,包括,物理,诱变,和,化学,诱变,。,所以,诱变剂,也包括,物理,诱变剂,和,化学,诱变剂,。,（,1,）常用的,物理,诱变剂,：,主要为,各种,射线,，包括：,x,射线、,r,射线、中子（快、慢,、,热中子）、,a,粒子、,粒子、紫外线等。,紫外线,是使用最广泛、最有效的,诱变剂,，在无菌条件下（超净工作台）用紫外灯照射处理即可。但应注意为避免,DNA,的光修复、降低诱变频率，紫外线处理后必须在黑暗条件下培养。,种 类,发 生 源,能 量,诱入组织能力,x,射线,x,光发生机,50-300,千伏,几毫米至几厘米,r,射线,放射性同位素,60,Co,，,137,Cs,几百万电子伏,很多厘米,中子,加速器或核反应堆,小于,1,电子伏至几百万电子伏,多厘米,粒子,放射性同位素或加速器,2-9,百万电子伏,十分之几毫米,粒子,同上,几毫米,紫外线,紫外灯,几毫米,表 常用的物理诱变剂（引自王敬驹，,1987,）,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（,2,）常用,化学,诱变剂,：,有下列几类：（,5,大类）,1,、烷化剂：,2,、天然碱基结构类似物：,3,、叠氮化合物：,4,、吖啶类染料：,5,、其它：,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,（,2,）常用,化学,诱变剂,：,1,、,烷化剂,：这是一类含有一个或多个,活化,烷基,的化合物，如,N,甲基,N,硝基,N,亚硝基胍（,NG,，,NTG,或,MNNG,）、甲基磺酸乙酯（,EMS,）、乙烯亚胺（,EI,）、硫酸二乙酯（,DES,）、亚硝基甲基脲烷（,NMV,）、,N-,乙基,N,亚硝基脲（,NEV,或,ENU,）等。它们能与,DNA,分子中的,碱基,或,磷酸基,结合，使之,烷化,，引起像天然碱基类似物一样的,碱基,错误配对,，从而导致,变异,。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,2,、,天然碱基结构,类似物,：如,5-,溴尿嘧啶（,BU,）、,5-,溴去氧尿嘧啶（,Bucr,）、,氧基嘌呤（,AP,）、马来酰肼等，此类物质能掺入,DNA,分子中，使,DNA,在复制过程中发生,碱基,交换,（,GC,AT,GC,）,3,、,叠氮,化合物,：如,叠氮化钠,（,NaN3,），这是一种,有效,诱变剂,（对植物诱变效果最好），能获得很高的突变体频率（诱变率为,40%50%,或,70%,）。诱发的大部分是,基因突变,，极少数为染色体异常。它诱变力强，且较安全，无持续性，处理方便。,第二节,植物细胞突变体的筛选,五,、,细胞突变体,的诱发和筛选,4,、,吖啶类,染料,：如原黄素、吖啶橙、,5-,氨基吖啶和溴化乙锭等，均为有效的,移码,突变剂,。它们能嵌入,DNA,分子中间，使一对（或少数几对）,核甘酸,增加或缺失，从而造成移码突变。,5,、,其它,：如,羟胺,（能与,DNA,分子中的胞嘧啶起作用）；,亚硝酸,（能使,DNA,碱基脱除氨基）等等。,植物原生质体分离,原生质体纯化,原生质体融合,杂种植物鉴定,愈伤组织形成器官化分植株再生,细胞杂种的选择,图：植物细胞融合程序示意图,(1),双亲原生质体制备,(2),采用酶法分离原生质体,(3),影响原生质体活力的各种因素,(1),筛网过滤,(2),采用界面法化分原生质体,(3),质膜稳定剂和渗透压稳定剂,(1),盐融合法,(2),高钙和高,PH,值法,(3),聚乙二醇法,(4),聚乙二醇和高钙,、,高,PH,值结合法,(1),互补选择法,:,反化互补、遗传互补、 营养互补,(2),可见标志选择法：凹穴培养皿法、 微吸管法,(1),基本培养基筛选,(2),激素种类和浓度调节,(3),渗透压调节,(1),与亲代形态特征比较,(2),杂种植物核型分析,(3),同工酶谱分析,