心脑缺血的研究方法

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,心脑缺血研究进展,（一）缺血模型的建立,缺血性脑血管病以发病、死亡、致残率高而极大地危害着人类健康；,因此, 模拟人类缺血性脑血管病的发病过程, 建立重复性好、观测指标易于控制的脑缺血动物模型一直是人们普遍关注的课题。,1. 实验动物的选择,( 1 )非人灵长类,猴、猩猩、长臂猿等大型灵长类动物在脑功能、脑血管分布及脑内各结构的比例上均最接近人类,是研究脑缺血的理想动物。但它们价格昂贵,来源困难,不适合作大型研究。,小型低等灵长类动物树鼩( Tupaiidae) ,尽管其分类地位仍有争议, 但较啮齿类、猫、狗等动物更接近于非人灵长类,而且因其大脑较发达,脑/ 体比重值大、价廉易得等优点弥补了猕猴、猩猩等大型灵长类动物的不足。,用树鼩进行脑缺血的实验研究有较高的应用价值。,原猴被认为是最原始的灵长类动物，其中包括树鼩、狐猴、瘦猴和眼镜猴等四个类别（见体质人类学）。,树鼩（,Tupaia glis,）作为实验动物，其在解剖、生理特征上是除猕猴等灵长类动物以外与人最接近的动物；也是WHO呼吁用之代替日趋濒危的灵长目的动物。,由于树鼩的颅骨薄（其厚度仅为大鼠的1/3），易于光化学反应的特殊光束透过颅骨诱导血管内皮损伤和血栓形成。,( 2 )猫、狗,这些动物属于哺乳纲的食肉目。猫、狗的脑皮层较发达,脑内各结构的发达程度和各部分比例与人脑较为接近,可同时对脑的不同部位做多次检查,适用于大脑皮层定位和观察各种反射的研究; 但它们的脑血管走行及脑的血供与人脑差异较大。,猫脑的大部分血液由颈总动脉通过颈动脉网与脑底动脉吻合来供应。,狗的颈内-外动脉间有异常丰富的吻合网,脑可以通过许多侧枝循环得到血液供应。因此它们对血,流阻断具有较强的耐受力,使其单根颅内动脉阻塞难以形成稳定的脑梗死灶。,( 3 ) 家兔,为哺乳纲的兔形目。其颅内主要供血动脉为,颈内动脉,且颅内外血管间吻合网少,大脑中动脉主干阻断后,其它侧枝循环对缺血区脑组织的代偿性供血作用小,有利于脑梗死模型重复、稳定的建立。,但兔大脑皮层部分不发达,皮层薄,沟回较少,在制作皮层梗死时效果不够理想。并且约10 %的家兔具有,两支中动脉,阻断其复制脑缺血时应予注意。,( 4 ) 猪,猪和人在解剖、生理、营养和新陈代谢等方面有很大的相似性, 是研究人类疾病的重要动物模型。,但有学者提出猪脑血管动-静脉吻合网丰富,侧枝循环较多,不利于脑梗死模型重复、稳定的建立 。因此,它较少用于脑缺血,而主要用于冠心病等心血管疾病方面的研究。,( 5,)啮齿类,目前大多数实验室选择啮齿类动物作为研究对象,尤其是大鼠和沙土鼠应用较多。原因为:,大鼠品种多（,Sprague Dawley rat, SD大鼠;Wistar大鼠,）,成本低,能够为动物保护者所接受;,种系纯,脑血管解剖和生理机能相似,梗死部位相对容易控制,实验重复性好;,抗感染能力强,存活时间长,利于脑缺血后急性、亚急性和慢性相关病理改变过程的研究;,有关系列大鼠的生理、药理和生化方面的实验资料可供分析比较;,沙土鼠缺乏后交通动脉,闭塞一侧或两侧颈总动脉即可复制效果明显的同侧或双侧脑缺血模型。,其缺点是:,鼠颅内外血管吻合网发达,在仅阻断颅内血管而不相应处理颅外血管时,脑皮层的缺血不严重;,一些临床不常见症状,例如呼吸困难、癫痫发作、意识障碍难以恢复等,致使它们的神经功能障碍难以评定 。,3. 麻醉剂的选用,脑缺血动物模型复制的成功与否,麻醉剂的选择十分重要。有证据表明全身麻醉剂可直接或间接地影响,脑血流、脑代谢、神经递质的传递,甚至膜的结构等。,国内多采用动物一般状态下的水合氯醛、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠或,乌拉坦,麻醉。其中,戊巴比妥钠对动物生理指标影响较小,可优先选用;,而常规剂量的苯巴比妥钠、乌拉坦可使脑温明显下降,成为极强的脑保护因素,乌拉坦尚具有溶血作用。,目前国际上脑缺血研究常用的麻醉方法是使用肌松剂+人工辅助通气+氟烷吸入麻醉,术中连续监测心电图、血压及血气。整个过程接近人类的手术麻醉过程。,4. 血糖浓度的影响,许多研究证实高血糖可加重缺血性脑损伤,使梗死面积增加,并且在不完全性脑缺血中这一作用尤其明显。其原因可能涉及：,糖无氧代谢、酸中毒、自由基、兴奋性氨基酸,钠、钾、钙离子的平衡。,同时，由于葡萄糖为脑内主要的能源物质，所以低血糖也可造成不利影响。,因此，除专门研究血糖对脑缺血的作用外，其它脑缺血实验有必要监测和控制血糖浓度。,缺血模型的复制,血管凝闭法,结扎血管法,异物栓塞法,血栓形成（或栓塞）法,血栓形成及栓塞模型的实验方法,血栓形成及栓塞是危害人类健康的常见多发病。在探索这类疾病的病因发病过程中，动物模型的建立是不可少的手段之一，尤其在临床治疗学方面的应用更具有重要的地位。因此，本文将一些有关血栓形成及栓塞的方法学作一综合介绍，以供参考。,一、外周血管血栓形成模型的复制方法,二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法,三、栓塞模型,一、外周血管血栓形成模型的复制方法,（一）实验性动脉血栓形成,1动脉吻合法：在麻醉大鼠颈部切口，分离20mm长的左颈总动脉。用动脉夹夹住其远端，继而夹住近端，于两夹之间切断动脉，生理盐水冲洗后，在手术显微镜下行动脉吻合术。当缝合第6或第7针时，自股静脉注入药物。缝合完毕后移去远端夹子，待反流性出血止住（23分钟），便移去远端夹子，血流能顺利通过吻合处即可。30分钟后，再次夹住动脉，用10%缓冲甲醛复盖固定，处死动物后取样本作组织学检检（连续切片，厚7,）。用含100个小方格的目镜，按下式测量血栓形成百分率：,血栓所占的格子数,血栓形成率（%）= 100,管腔内总的格子数,2电刺激法：分离大鼠一侧颈总动脉15mm长，用,两个不锈钢电极轻轻托起动脉，以1.5 mA电流刺激7.5分,钟。用稳压器使电流保持恒定。电热变阻温度计一直与,动脉头端接触，从而连续记录血管的表面温度。也可用,半导体点温计间段测量血管表面温度，伤口附近用小塑,料而遮盖以免受组织温度的影响。从刺激开始至温度突,降的时间即血小板血栓形成使动脉堵塞的时间（OT），,用于药物效力分析，并作组织学检查。,本实验若用家兔进行，则全过程以压力换能器监测,血压、电磁流量计测其血流量，持续刺激120分钟或至,动脉血流停止为止。,3动脉袢法：将20cm长的聚乙烯管（内径1mm，外径2mm）置于热水中折成袢状，并扎线以固定。用时剪去两端，硅化后灌满肝素即可使用。,在麻醉大鼠左腹部备皮，行左旁正中切口，长3cm，分离肾动脉至髂腰动脉一段，于精索内动脉和髂腰动脉处上夹；分别将动脉袢的两端插入腹主动脉内，结扎固定后移去夹子恢复血流，缝合肌层并夹住皮肤，使部分袢凸出体外以便观察。,动物颈部用塑料硬领圈住（外径12cm，内径2.53.0cm），以防动物咬断动脉袢，注意观察袢的色泽变化，记录堵塞时间（OT）。,4、,硝酸银刺激法：分离家兔腹主动脉，用一根1.5cm长的塑料槽套住动脉，以使动脉受到一定长度的损伤。,在塑料槽内滴加20%硝酸银溶液。，当血小板和纤维蛋白原标记后1小时内，即可诱发血栓形成。3小时后，小心切开血管，取出血栓，立即（30秒）称重并测其放射活性。,cpm/血栓,具有放射性的栓子大小= x100%,Cpm/ml血浆,（二）实验性静脉血栓形成,1静脉结扎法将大鼠麻醉固定，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉分枝处结扎下腔静脉，随后关腹。结扎后2小时重新开腹，夹住远端，用注射器吸尽结扎处与夹子之间血管内的血液，纵剖该段血管并取出栓子，置真空干燥器内24小时，测其干重（结扎后6小时，100%成栓），并计算血栓形成百分率。,本实验可在家兔颈静脉进行，即夹住游离的颈静脉近端使之闭塞，血流充盈后再结扎其远端。30分钟后切开该段静脉，按以下标准判定结果，即：,O级无血栓形成；,I级显微镜下纤微蛋白丝；,级数个小栓子；,级两个或两个所上较大的栓子；,级单个大栓子。,2凝血酶促凝法：分离狗股静脉5cm长，结扎小分枝，肌皮枝除外，由该静脉插入5cm长的导管，并向静脉腔内引入一根4cm长的毛线，止血后用夹子夹住游离的股静脉近端和远端，经侧枝插管并排空余血，便注入生理盐水，立即注入含放射活性的纤维蛋白原血液，并快速注入0.1ml凝血酶（100 NIH u/ml），凝块便很快形成。,此后，移去两端夹子，血同侧足背静脉注入60%泛影葡胺5ml作静脉造影术，并测凝块的放射活性。,（三）动-静脉短路法,将麻醉的家兔进行人工通气，无菌条件下暴露颈外静脉和颈总动脉（或股动），在动脉近端放一个内径为3或3.5mm的流量换能头以描记动脉血流量后，分别夹住动、静脉，切开插入A-V短路管（充满生理盐水）并固定之。,A-V短路装置:分别作动脉和静脉插管。静脉端插管用可调节夹夹住，以控制通过短路的血流量。各接头应与血管中心线相一致，勿弯曲。短路插入后，将流量调整为200ml/分，记录稳定后，小心夹住管道，拔出接头，在此处安置一块22cm，含40,m小方格的聚酯网后再次接上，聚酯网被绷在管腔面上，移去夹子，恢复A-V短路血流量，并记录血流开始至停止时间。短路闭塞时间取决于聚酯网上闭塞的血栓形成。用电磁流量计监测。,3钢线诱导法：在麻醉大鼠腹部手术，暴露左肾静脉处下腔静脉，将一根带尖的不锈钢导线自下腔静脉分枝徐徐插入，朝髂静脉方向轻轻捻导线，使之倾斜于腔静脉内，导线由23个螺旋（平均间隔0.7mm）和尖端组成，直径0.1mm，外径0.80.4mm，内径0.70.3mm（逐渐变细），长20mm。导线后端需固定以防流向右心房。插入管腔的导线为19mm，此后，缝合切口并消毒包扎。,血栓的测量：于插入导线后不同时间（任选）处死动物，在3.8%枸椽酸冲洗下，纵剖血管，小心取出附着栓子的导线，生理盐水冲洗后，置碱性溶液（20%Na,2,CO,3,于0.1N NaOH中）内沸水浴3分钟，比色测定其蛋白含量。,二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法,（一）血栓形成模型：,1冠状动脉血栓形成；在麻醉狗颈部手术，插管接正压呼吸，于左胸廓第4肋间开胸，打开心包，在右心耳处插管以供输药用。钝性分离冠状动脉左旋枝12cm长，使之与周围组织游离，将电磁流量探头固定在该动脉上以监测左旋枝血流理。,冠状动脉刺激电极与头皮针针尖焊接而成，将电极插入左旋枝管壁23cm，使之与血管内膜层紧密接触,电极与250,000 的电位计，9V的镉-镍电池及数字电流计相串联，将盘形电极缝合于胸部皮下，接通电流。,刺激电线的设计在于能恒定监测并易于调整正电流，以直接刺激左旋枝内膜表面。,6小时,后，剖开左旋枝取栓称湿重，并作心肌组织切片、左旋枝动脉光镜及电镜检查。,花生四烯酸诱导法：分离家兔右颈动脉，并插入聚乙烯管，其尖端位于右颈外动脉开口处，给动物注入0.7mg/kg的花生四烯酸钠（或ADP30mg/ml/kg）后10分钟，1mg的依文氏半溶液自股动脉注入，并在动物颅骨中线两侧行开窗术，于外科显微镜下观察大脑表面的变化。注入花生四烯酸钠后1小时，在150cmH,2,O压力下，从左室插管内注入2.5%戍二醛或10%缓冲甲醛固定器官。,此后，在外科显微镜下，除去蛛网膜下腔前、中、后动脉，扫描电讯镜观察脑内血管的改变。当花生四烯酸钠剂量大于0.45mg/kg时，EEG显示出规律的急性损伤电波，且脑血流降至365l/秒,-1,约降50%.,三、栓塞模型,（一）肺栓塞模型,1微聚物栓塞法：将分离出的羊血浆纤维蛋白原加凝血酶使之凝固成纤维蛋白微聚物（FMA）经甲苯磺酰精氨酸甲酯和磷酸缓冲盐冲洗后，制成磷酸缓冲盐混悬液，用高频声裂使凝块沉淀，直至聚合物直径约为50m时为止。,将纯化的凝血酶（6013NIH u/kg）和纤维蛋白微聚物(0.320.009g蛋白/kg)自颈静脉导管注入,在右心得以充分混合,从而造成肺栓塞,每30分钟测一次淋巴蛋白、肺血液动力学、WBC、血小板、纤维蛋白原及纤维蛋白原及纤维蛋白降解产物水平。,2、颈静脉内成栓法：分离一侧颈静脉及另一侧颈总动脉，颈静脉长度至少4cm，结扎所有小分枝，切勿使静脉主干受损。将动、静脉插管内充满生理盐水，关闭静脉导管与三通和通道，随后夹住游离的颈静脉近端使之充盈，在距静脉夹45cm处结扎颈静脉远端，切开并插入插管探头，用丝线固定，开夹，以排空静脉，并重新夹住待用。,栓塞过程：用1ml，10分钟后，移去静脉夹，释放第一枚栓子，并以同样方法做第二枚栓子。于给 药前后不同时间取血测纤溶指标，取栓称重，并作栓子扫描电镜观察。,2脑动脉血栓形成：,光化学反应法：局部脑血栓形成：将健康雄性Wistar大鼠用2.5%硫喷妥钠麻醉（40mg/kg体重），卧位固定动物并消毒皮肤，切开右顶部头皮肤1cm，暴露右侧颅骨，细心分离软组织以免损伤颅骨表面而影响其透光性。于皮下嵌入一块11.4cm的消毒铜片，其中心留0.50.6cm窗孔，以便光源通过该窗孔直接照射于颅骨表面。铜片以外的组织用避光纸遮盖。,自尾静脉一次注入浓度为7.5mg/ml的孟加拉红（Ros Bengal）生理盐水溶液0.133ml/100g体重（可使体内浓度为1mg/100ml）；循环10分钟后，将大鼠置“实验装置”内，在光强度为0.5W/cm,2,条件下照射20分钟（用时间继电器控制）。,此后将动物移至饲养笼内观察，分别于1、4、24小时及3天后再次麻醉动物并检查有关指标。,光化学反应的条件,1、,光源,2、,孟加拉红,3、氧分子,孟加拉红(Rose bengal)吸收光能后产生单线态氧的量子效力为76%，为已知光敏物质中效果最佳的一种其吸吸光能后的反应为：,孟加拉红So孟加拉红S,1,(激发单重态),孟加拉红S,1,孟加拉红T,1,(激发三重态),孟加拉红T,1,+,3,0,2,孟加拉红+0,2,(单线态氧),0,2,+底物氧化反应(即光化学反应）,使之生成激发单重态，继而使血管内皮细胞表面的易感分子（如不饱和脂肪酸和某些蛋白质）发生直接过氧化，以致血管内皮细胞受损而诱导血栓形成。,3、腔静脉内成栓法：手术暴露狗腔静脉至髂静79cm长一段腔静脉，结扎所有分枝，经股静脉插入导管，在肾静脉和髂静脉处用两个夹子夹住腔静脉（须排空），用塑料主射器（含钽粉23ml）自股动脉取血，将血与钽粉充分混匀，用34ml去纤维蛋白的人血浆或60凝血酶诱导血栓形成。振摇混合1015秒，便注入腔静脉内，使其足以恢复原始容积即可。30分钟后，移去静脉夹，释放栓子并作放射摄象、光扫描及肺血液动力学测定。,4纤维蛋白原标记法：,血栓制备：取全人血0.5ml加81,125,I标记的人纤维蛋白质(10cpm),25mMCaCl,2,501加入凝血酶21(终浓度1NIH/m1),注入一根内径为3mm的聚乙烯管内,室温预浴15分钟,切取导管的中间部分(1.5cm长,0.1m1血栓),放于玻璃器皿内,用0.15M NaC1反复洗涤并测定,125,I含量。然后，游离家兔一侧颈静脉并由上输入血栓，小心缝合静脉以恢复血流，自对侧耳缘静脉输入药物。处死动物后，小心剖开肺动脉，找到具放射活性的血栓，取出测其,125,I含量。以评价溶栓程度。,5体外成栓法：取自体血加凝血酶（10/ml）,混合凝固,切凝块为35mm的立方体,并用生理盐水洗,涤,此后由右心房输入,以张力计量换能器测量MAP、,MPAP 、CO 、PVR、血气及pH变化，或肺动脉造影。,（二）脑栓塞模型：,1粥样斑块栓塞法：栓塞物制备即自尸检中取粥样斑块，将其制成125mg/ml的无菌生理盐水悬液，经匀浆机沉淀；于结核菌素注射器上接16号针头,抽取混悬物,剂量为3080mg之间.另备1ml生理盐水和80mg同种肝(125mg/ml)作对照(粥样物剂量分别为:30、40、50、60、80mg。,步骤：手术暴露兔右颈总动脉，将粥样物缓缓注入动脉内，轻压穿刺部位2-4分钟止血。注意观察存活动物的行为特征。动物处死，在100mmHg灌注压下取脑，用3%戊二醛磷酸缓冲盐或3%三聚甲醛缓冲液固定24h。,将脑切为3mm厚的切片并系列展开，以检查梗塞部位，并作光镜和电镜观察。,2血凝块栓塞法：凝块制备：自大鼠心脏取血0.1ml，置室温48小时便形成凝块。用接有26号针头的注射器将凝块吸入并注至生理盐水内，反复抽吸三次，使凝块破碎，即成为各种大小不同的碎片（100）悬液,取0.2ml作脑栓塞用。,栓塞过程：手术暴露左颈总动脉分枝颈内、外动脉，勿伤迷走交感神经丛。在颈总动脉分枝上夹，距分枝15mm处穿线备用。经26号针头吸取栓子悬浮并由颈总动脉向其远端注入，拔针后，用外科粘合剂密封注射部位，去夹，恢复血流，作临床观察并处死动物进行组织学检查。,以上诸方仅从动物模型的角度加以介绍，有的适用于防栓研究；而有的则为溶栓所借鉴。在观测指标方面，常用的为栓重、血管闭塞时间、成栓率以及纤溶活性测定等，随着现代科技的飞速发展，酶标、放免、电镜及电子计算机技术的应用将给血栓形成及栓塞的治疗监测打开新的局面。基于血栓形成的复杂病因，在建立和应用动物模型方面尚有大量的工作值得研究。,3).血小板受损,血小板,颗粒: FgN, TSP, FN,致密颗粒：5-HT, ADP, CA,血小板聚集三途经:,1.ADP途经,2.AA途经,3.PAF途经,3.PAF途经,血小板聚集:,血小板GP,IIb,/,IIIa,-Fgn-GP,IIb,/,IIIa,血小板,血小板黏附:,血小板GP,Ib,-vWF-胶原（血管),TSP,（,Thrombospondin,凝血敏感素）：,为一种多功能蛋白质，能与纤维蛋白原、,FN,、肝素、凝血酶、胶原、富组氨酸蛋白等作用，对血栓形成具有调节作用。,FN（,Fibronectin,，纤维连接蛋白）：,可通过分子中的纤维蛋白结合区域与纤维蛋白结合，从而抑制纤维蛋白凝块的形成。,-TG（,-Thromboglobulin, -血栓球蛋白）:,可加速纤维蛋白的形成，促凝血。,PAF（,Platelet activating factor,，血小板活化因子）：,为当前发现的促血小板聚集最强的因子，主要通过“第三途径”诱导血小板聚集,常用的局灶性脑缺血模型的建立,随着经济的全球化，以及科技进步与社会发展的需要，医药工业的发展的前景 十分广阔。,但由于我省医药工业产值较低，（在全国医药总产值中的比重低于1%，科技含量不高，缺乏竞争实力，药物研发过程中所采用的部分实验模型与人类疾病病理过程相距甚远，以至一些实验效果明显的药物难以在临床上观察到相应的疗效。,因此，既耗费了时间、精力及金钱，又消耗了大量的动植物资源。,在当前生态环境日趋化，药用资源日见匮乏的情况下，以科学的思维，严密的设计对临床常见病，尤其血栓性局部脑缺血展开深入的研究，不仅有利于我省医药事业的创新与发展，还有利于“动植物王国”天然资源的合理开发与保护。对我这对我省绿色经济强省的建设具有重要的现实意义。,由于我国加入WTO及国际知识产权的保护,我国医药发展面临严峻的挑战。,因此，在跟踪国外心脑血管疾病发病机理及防治研究的同时，发掘我国我省民族民间医药宝库，走符合我省实际的药物研发创新道路，不仅是医药科技工作者当前亟待解决的问题，也是我国未来经济建设中坚持可持续发展战略的重要组成部分。,常用的局灶性脑缺血模型及特点,物理方法诱导的脑缺血模型,开颅机械闭塞大脑中动脉法,大脑中动脉(middle cerebral artery, MCA) 供血区是人类脑卒中的多发部位, MCA闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，而造成MCAO的最直接方法即为开颅闭塞法。,目前较常用的是经颞下或经眶入路开颅, 结扎、夹闭或电凝阻断MCA, 造成MCA供血区的缺血损伤。,微栓子栓塞法,该法是一种经颅外动脉注入栓塞物到颅内动脉以造成脑缺血的方法, 已有60多年历史, 其方式也不断改进。,栓子制作是该模型成功与否的关键, 如栓子的大小、成分、形态及栓塞部位均会影响模型效果1碳素颗粒、空气、石蜡、树脂微粒等都曾作为栓子从颈内动脉注入到MCA主干及分支引起MCA供血区缺血;其中血凝块栓子的应用, 对评价溶栓剂的溶栓效果具实用价值。,线栓法,1986年Koizumi等率先从颈外动脉向颈内动脉中插入尼龙线, 依靠插线前端和侧壁阻断MCA 起始端及侧支的血液供应, 形成MCAO模型; 一定时间后拔出插线恢复血流, 制作出再灌流模型。,这种非开颅的可逆性MCAO模型具有较大的优越性而被广泛应用。但实践中发现, 许多因素如插线的直径、性状、插入深度、动物种属及体重等均会影响实验效果。,电刺激法,Rebello等将阳极刺激电极置于狗颈动脉内膜处, 阴极电极置于远隔部位的皮下, 在刺激部位的上游处监测血流1用300A的电流刺激破坏血管内皮使局部形成血栓。,成功溶栓后, 由于血管内膜损伤及残余血栓在血流切应力和释放介质的作用下, 促进血小板聚集和血管收缩, 可出现新的血小板和纤维蛋白沉积, 进而导致再梗塞。,机械压迫皮质梗塞法,结扎一侧颈总动脉, 采用直径为45 mm的配有激光多普勒探头的圆柱形黄铜压迫对应皮质的硬脑膜1 h, 保持皮质微血管的血流量在正常值的18% 20% ；梗塞灶局限在被压迫区的皮层, 而无深层白质和其它皮层的损害, 无出血现象。,局灶性脑缺血模型的方法学评价,形态学评价,1、TTC染色,TTC即氯化三苯基四氮唑( triphenyltetrazolium chloride) 。用于脑组织染色(正常组织呈鲜红色, 梗塞组织呈白色) , 通过测量脑梗塞面积或体积来衡量缺血的程度.。,TTC染色法虽然能够直接、定量地观察梗塞病灶, 其局限性: 需处死动物染色后才能判定模型是否成功;。染色后的组织不宜做诸如免疫组化等指标的后续观察。,光镜观察,光学显微镜与苏木素伊红染色（HE染色法）技术相结合可观察到脑缺血后神经元肿胀、轮廓不清、空泡样变性及核固缩等一系列病理形态学变化, 简便易行。,电镜观察,电子显微镜的应用使形态学研究进入了超微水平。电镜下可观察到缺血神经元线粒体肿胀,、嵴崩解、内质网池扩张变形, 粗面内质网脱颗粒等结构改变。,此外, 电镜技术与其它技术(组织化学、图像分析仪、能谱仪) 的结合, 可实现组织化学研究、形态定量及元素成分的分析, 进一步揭示缺血后结构与功能的关系。,磁共振成像,(MRI),是利用收集,磁共振,现象所产生的信号而重建图像的成像技术。为一种非创伤性、敏感的检测方法；对确定脑缺血早期的解剖、生理及生化改变具有重要价值。,用此技术对活体动物在无创条件下检测梗塞面积, 具有其它方法不可替代的优越性。,此外, 磁共振成像在缺血损害3 h后即可把梗塞部位在加权图上呈现出来, 能结合组织病理学的改变, 为早期诊断和治疗提供依据。,2,神经机能学评价,行为学评价,（一般多采用改良Bederson评分或Longa评分）,Bederson评分标准 Longa评分标准,0分: 无神经功能缺损症状 无神经功能缺损症状,1分: 对侧前肢屈曲 同侧Honer征,2分: 拉尾时对侧前肢抓力下降 对侧前肢不能完全伸展,3分: 抓尾时向对侧转圈 身体向对侧倾倒,4分: 自发向对侧转圈及意识障碍 向对侧转圈,评分小于2 分者将被淘汰而不进行后续的实验。,应注意的是, 动物神经功能缺失症状与损伤范围并非总呈正相关的关系, 若判定时带有主观性, 将难于做出客观评价。,脑电图（EEG）观察,脑缺血可引起脑电波的抑制, 缺血区脑电图出现波幅降低, 频率减慢,并且EEG改变的程度与脑损伤的范围具有相关性。,因此, 通过对术前、术中及术后的脑电的动态监测, 对于判断阻塞成功与否, 并反映脑缺血的范围和程度；,还可将脑电活动用于评价神经保护剂的效果。,脑血流（CBF）监测,猪和狗等大动物可通过血管造影直接观察。对于小鼠、大鼠等小动物可用激光多普勒（LDP）血流仪监测血流。,通常将激光探头固定于颅窗上, 只要保证激光探头在整个过程中无位置移动及转动, 即可准确测定该部位的血流量。,当血流降到基础值的10% 20%即认为梗塞模型制备成功。,研究发现, 术中脑电波的抑制较激光多普勒监测到的CBF降低晚5 10 s, 故认为术中双侧LDP血流监测对判断血管闭塞程度更敏感、更有效。,1. 心脏染色,硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，,四唑氮,蓝）系异环族化合物四唑加孵育液至全部覆盖组织，于37温箱中孵育4560min .,梗塞大小的测定:,用伊文思蓝+NBT双重染色 ,用称重法测量梗塞大小。,梗塞大小用坏死区（IS）在危险区（AAR）中所占的百分比表示。,心肌染色法,2. 心肌染色,目前常用的Masson三色染色法染出的组织切片虽然颜色艳丽、色调对比分明，但容易褪色、难以长久保存。,现介绍一种改良Masson三色染色法，经实践证明染色稳定且不易褪色，可长时间保存，现介绍如下。,1. 材 料,1.1 Bouin液饱和苦味酸水溶液75 ml，甲醛25 ml，冰乙酸5 ml。,1.2液1%比布列西猩红水溶液90 ml，1%酸性品红水溶液10 ml，冰乙酸1 ml。,1.3液磷钼酸2.5 g，磷钨酸2.5 g，蒸馏水100 ml。,1.4液苯胺蓝2.5 g，冰乙酸2 ml，蒸馏水100 ml。,2. 方法,常规脱蜡置Bouin液室温56 1 h，流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；,Weigert铁苏木精染核10 min，盐酸乙醇分化，流水冲洗10 min，蒸馏水洗；,液染2 min，蒸馏水洗；液染15 min；液染5 min，蒸馏水洗；,1%冰乙酸溶液浸洗5 min，常规脱水透明，中性树胶封片。,3. 结果,改良的Masson三色法染色，清晰地显示: 心肌(包括特殊心肌-传导系统)及胶原纤维；,结果：心肌着红色,胶原纤维呈蓝色,细胞核蓝黑色,（切片长期不易褪色）, 中山医科大学,谢 谢！,