微生物与制药3

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,辽阳职业技术学院制药微生物,微生物与药学,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,微生物与制药3,微生物与制药3微生物与制药3药物的抗菌试验 药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的抑菌试验；,测定药物杀菌活性的杀菌试验；以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试验等。,一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。,药物的抗菌试验,药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的,抑菌试验,；,测定药物杀菌活性的,杀菌试验,；以及检查两种药物联合作用的,联合抗菌试验,等。,一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。,药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。,在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、,PH,值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。,虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物,体外抗菌试验和体内抗菌,试验可能会出现不一致的结果。所以，一般我们在,体外,对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。,第一节 药物的体外抑菌试验,一、药物的体外抑菌试验,（一）体外抑菌试验,药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。,稀释法,稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（,MIC）：,是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用,gml,或,U/ml,表示。,具体的液体培养基连续稀释法见书本，固体培养基连续稀释法,，,又可分为,平板法,和,斜面法。,2.琼脂扩散法,利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验,。,1.,滤纸片法（纸碟法）,滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分,湿、干,两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。,干燥纸片的制备方法,：,选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6,mm,直径的圆纸片，120干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5,ml,药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37，使它干燥，分装小瓶中，封口，4保存,.,一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。,世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如,：,抗生素或化疗药物 抑菌圈直径（,mm）,耐药 中敏 敏感,氯霉素 12 13-17 18,红霉素 13 14-17 18,四环素 14 15-18 19,卡那霉素 13 14-17 18,2.,打洞法,含菌琼脂平板上打洞,所以说微量法适于药物血浓度的监测。优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。除此之外还有,管碟法、直接滴加法和挖沟法,：适用于,测试一种药物对几种细菌的抗菌作用,。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察加细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。,(,二）、 体外,杀菌试验,杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。,1.最低杀菌浓度（,MBC）（,最小致死浓度,MLC）,的测定,按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的,MIC。,然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度（,MLC）。,如果是细菌的话可以称为最小杀菌浓度（,MBC）。,2.,活菌计数法,将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物的杀菌能力。,活菌计数一般是,将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数（,CFU),。,3.,酚系数测定（石炭酸系数测定）,酚系数是以酚为标准，将待测的,化学消毒剂与杀菌效力相比较,，所得的就是杀菌效力的比值。,苯酚系数,=,消毒剂的杀菌稀释,度,/,苯酚的杀菌稀释度,（苯酚系数大于,2,或等于,2,才合格）,由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。,具体的测定方法,:,是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取5,ml,放到试管中，再加入经24小时培养后的菌悬液各0.5,ml，,混匀后放入 20水浴中，5、10、15分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5,ml,的肉汤培养基中，37培养24小时记录生长情况。,（三）、 联合抗菌试验,1,、联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。,无关,作用小，两种药物联合作用的活性,等于其单独活性；,拮抗,作用，两种药物联合作用显著低于,单独抗菌活性；,累加,作用，两种药物联合作用时的活性,等于两种单独抗菌活性之和；,协同,作用，两种药物联合作用显著大于,其单独作用的总和。,常用方法,1.棋盘格法,棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的,MIC。,药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。,接种菌量为5105,CUFml，35,孵育,18,h,后观察结果。计算,部分抑菌浓度,（,FIC）,指数,0,5,为协同作用；,051为相加作用；,12为无关作用；,2为拮抗作用。,棋盘,法的设计,棋盘,法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。,在进行,棋盘,法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的,MIC，,然后以两药,MIC,的8倍、4倍、2倍、1倍以及,MIC,的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表1的青霉素,G,与链霉素联合药敏实验和表2的,TMP+SMZ,的联合作用。,药物及浓度 青霉素,G(IUm1),链霉素单药对照,4 2 1 0.5 0.25,链霉素,（,gml）,64 - - - - - -,32 - - - - - -,16 - - - - - -,8 - - - + + +,4 - - - + + +,青霉素,G,单药对照,- - - + + 细菌对照,-：,无细菌生长 +：有细菌生长,FIC,指数=11+1616=2无关,2.纸条试验,在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。,3.纸条梯度平板试验,将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培养基。将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养基，这样在制成的双层琼脂平板中含有梯度浓度的抗菌药物。,要求其最小抑菌浓度的位置约处于平板的一半。,然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取纸条浸透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的方向置于平板表面，培养后观察形成的抑菌区的图形以判断两种药物之间的相互作用,。,意义,目的在于：治疗混合性感染；,预防或推迟细菌抗生素耐,药性的发生；,联合用药可以减少剂量以,避免达到毒性剂量；,联合用药比单一用药时效,果更好。,二、,药物的体内抗菌试验,药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。,如血液及组织内的蛋白质或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。,因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。,三、影响抗菌试验的因素,1. 菌种,在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提供的标准菌株。,在特殊情况下，也可以采用临床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是,对数期生长,菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对于我试验测定的结果也会准确些。,1. 培养基,试验所用到的培养基应按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗代谢作用时，培养应不能存在代谢物，否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这类营养物。,3.,抗菌药物,药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物呈均匀悬液。,PH,值应调至中性，以确保药物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注意。,4.,对照试验,为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。,试验菌对照,：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。,溶剂及稀释液对照,：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。,已知药物对照,：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应,。,复习题：,1. 药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验操作方法？,2. 如何测定药物的最小致死浓度？,3. 联合抗菌试验常用的方法有哪些？,4. 药物体内抗菌试验的方法？,5. 抗菌试验的影响因素有哪些？,实验 细菌对药物敏感性的实验,（药敏片扩散法）,目的意义：,掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法,体会药敏实验在临床用药上的指导意义,基本原理：,药敏片是含有抗生素的滤纸片，将其置于涂满待测菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内扩散，抑制细菌生长，从而出现抑菌环。根据抑菌环的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。,器材及试剂:,药敏片：含各种抗生素的市售产品,培养基平板：普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，待检细菌的培养物。,眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。,实验步骤:,1、用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布,平板，待稍干后， 用无菌眼科镊将各种药敏,片分别平贴在平板培养基表面，每板4-6个，,相互间应有一定距离（15,mm）。,2、,置37,，培养8-12,h，,观察结果。,3、结果判定：观察有无抑菌圈,及测量其直径，按下表判定,对药物的敏感性。,中国药典2000版二部微生物限度标准,(单位：个/,g,或个/,ml),编号,剂型,细菌数,霉菌、酵母菌数,大肠,杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,1,片剂,1000,100,-,2,酊剂,100,100,-,3,胶囊剂,1000,100,-,4,软膏剂,100,100,-,-,5,一般眼膏剂,100,-,-,-,6,一般滴眼剂,100,-,-,-,7,丸剂(滴丸、糖丸等),1000,100,-,8,气雾剂,100,10,-,-,-,9,糖浆剂,100,100,-,活螨的检验,用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨,直接观察法,漂浮法,分离法,人有了知识，就会具备各种分析能力，,明辨是非的能力。,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,古人说“书中自有黄金屋。,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,培养逻辑思维能力；,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,培养文学情趣；,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,给我们巨大的精神力量，,鼓舞我们前进,。,