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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,几种抗菌药物的最小抑菌浓度的测定MIC试验,（微量肉汤二倍稀释法）,一、目的,1、掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤，能准确测出各种抗菌药物的MIC值，了解单药的抗菌活性,2、为后面的棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘的中心浓度,二、意义,1、通过对MIC值的测定了解药物的,体外,抗菌活性,2、为临床选药提供依据,3、耐药检测,三、菌种,1、大肠杆菌（标准菌株25922）,2、沙门氏菌（标准菌株）,3、金色葡萄球菌（标准菌株）,（以上三种菌株均由中国兽药监察所提供）,四、药品,硫酸庆大霉素（批号： 含量： 厂家： ）,阿莫西林（批号： 含量： 厂家： ）,硫酸四环素（批号： 含量： 厂家： ）,恩诺沙星（批号： 含量： 厂家： ）,阿米卡星（批号： 含量： 厂家： ）,氟苯尼考（批号： 含量： 厂家： ）,五、培养基,MH肉汤培养基、用去离子水配制5g/L显色剂TTC（氯化三苯四氮唑）,六、器材,96孔细胞培养板、培养皿、移液枪、 1ml和200,l,枪头、EP管、锥形瓶、试管架、酒精灯、酒精棉球等,分析天平、超净工作台、37度恒温培养箱、烘箱,七、方法步骤,1、药液的配制及除菌,配制 根据药物的效价或是含量及所需要的体积，计算出药物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌药物，用适宜的溶剂及稀释及稀释剂将药物稀释至所需的浓度。,除菌 抗菌素药物通过过滤的方式过滤；化学合成类药物通过过滤或是高压灭菌的方式进行除菌。,2、不同的抗菌药物原液配制所需的溶剂,溶剂为PH4.5PBS缓冲液的：四环素类,溶剂为PH6.0PBS缓冲液的：青霉素G，半合成青霉素类，头孢菌素类，多粘菌素B硫酸盐,溶剂为PH7.8PBS缓冲液的：氨基糖苷类，林可或氯林可霉素,3、MIC的测定（微量二倍稀释法）,第一步：在96孔板每个孔加入含TTC的空白肉汤100,l,。,图表,第二步：在A/B/C三排的第一孔加配好的药液A,(浓度为512IU/ml或,g,/ml)100,l,，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100,l,加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100,l,弃去;此时每孔药物浓度从左到右依次为：256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125(单位:IU/ml或,g,/ml),图表,第三步：再在每一孔中加入稀释好的菌液100,l,这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复（A/B/C三排样品）。此时每孔药物浓度即最终药物浓度从左到右依次为： 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06(单位:IU/ml或,g,/ml)；,图表,第四步：在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在H排上做一排阳性对照（加菌液不加药液）,第五步：将96孔板放入37度恒温培养箱1620小时后，观察结果。,图表,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,A,肉汤100ul,药A100ul,菌液100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,100ul,B,同A排,C,同A排,D,肉汤100ul,药B100ul,菌液100ul,E,同D排,F,同D排,G,阴性对照,H,阳性对照,药物,浓度,128,64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,第一步 第二步 第三步 第四步,八、观察及判断结果,1、若有菌生长TTC会显示红色；若没有细菌生长TTC则不变色。,2、MIC值的判定：96孔板上横排中未变红色的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。,3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果,4、记录结果并将每种药物的MIC值报告老师,九、注意事项：,1、无菌操作, 除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理, 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；,不能拿酒精面球球擦挡板！, 操作前洗手，用酒精棉球擦手, 每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；,移液枪和枪头不能在究竟灯上烤！, 操作过程中加液尽可能不将96孔板盖完全打开,2、其他注意事项：,（1）培养板上用标签纸做好标记，写明组别，做什么菌、什么药，以及各组对照。,（2）每药做三个重复，每个板做一个阴性对照和一个阳性对照。,（3）废液缸，超净台内用过的不需要的东西都必须放到废液缸内，不能在台面乱扔。,（4）实验完后要收拾好台面，所有公用设施恢复原位。,十、记录结果的格式,例如：菌对药的MIC值（,g,/ml或是UI/ml）,受试菌株,药物（ UI/ml ）,四环素 氟苯尼考,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,沙门氏菌,十一、讨论,1、微量肉汤二倍稀释法应注意那些环节才能准确测定MIC？,2、MIC试验对临床选药的意义以及它的局限性？,3、TTC的作用机理？,十二、分组,整个班分为6个组，每组11人。,1、2组做8种药对大肠杆菌的最小抑菌浓度,3、4组做8种药对沙门氏菌的最小抑菌浓度,5、6组做8种药对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度,1、2、3组在今天上午完成实验，4、5、6组在下午过来完成实验。每个大组要做4块96孔板，由4个同学来完成！,每组的物品清单,96孔细胞培养板（6块）、平皿3块、移液管1支、洗耳球一个、 1ml和200,l,移液枪各一支、 1ml和200,l,的枪头各一盒、试管架、酒精灯、酒精棉球、记号笔、废液缸等,MH肉汤（2瓶）、6种稀释好的药液、菌液,
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