微生物与基因工程

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第 十 章,微生物与基因工程,1,基因工程技术,基因工程（,genetic engineering),：,把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。,2,基因工程大事记,1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆;,1978 Genentech公司-人胰岛素-世界上第一种基因工程蛋白药物,1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用,1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼,3,1993,基因工程西红柿在美国上市,1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉,1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人类基因组全部序列的1%,2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图,2001.2.11 公布人类基因组基本信息,4,第一节 基因工程概述,三项重要技术为基因工程奠定了基础,:,1967-1970,年,R.Yuan,和,H.O.Smith,等发现的,限制性核酸内切酶,为基因工程提供了有力的工具；,1972,年,Berg,等将,SV-40,病毒,DNA,与噬菌体,P22DNA,在体外重组,成功；,1973,年,Cohen,和,Boyer,第一次将重组体,DNA,转化大肠杆菌，实现了,DNA,的分子克隆,; 1977,年,Boyer,等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子,14,肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这,14,肽；,1975-1977,年,Sanger,、,Maxam,和,Gilbert,先后发明了三种,DNA,序列的快速测定法,；,90,年代全自动核酸序列测定仪的问世；,5,一、基因工程基本过程,1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。,2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子；,3、转化：重组DNA分子导入细胞。,4、扩增该克隆DNA。,5、筛选与鉴定；,6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。,7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。,6,7,一切基因工程操作都离不开微生物,1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成的。,2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。,3、微生物细胞是基因克隆的宿主。,4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。,5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。,6、模式生物提供基础理论。,二、微生物与基因工程关系,8,第二节 基因的分离合成和诱变,利用重组,DNA,技术，可将某一原核生物或真核生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库,(genomic library),或,cDNA,文库,(,cDNA,library),9,1. 基因文库的构建,所谓基因文库是指生物染色体基因组各,DNA,片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的,DNA,片段。,一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部,DNA,序列）。,10,2、基因文库的构建步骤：,（1）从组织或细胞提取基因组DNA；,（2）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA 片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片 段；,（3）选择容载量较大的克隆载体，通常采用噬菌体或 柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；,（4）将基因组DNA片段与载体进行体外连接；,（5）重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组噬 菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组 DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。,11,2. cDNA文库构建,所谓,cDNA,文库是指生物体全部,mRNA,的,cDNA,克隆总体。,cDNA,文库中的每一个克隆只含一种,mRNA,信息。,由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样一个事实，即细胞中的,mRNA,分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有,15%,左右基因被表达），因而若由,mRNA,逆转录为,cDNA,，,那么所构建的,cDNA,文库的库容量相应比基因文库小。,12,构建cDNA文库的主要步骤：,从生物体或细胞中提取mRNA。,利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合成cDNA的第一条链。,利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链;常用RNA酶H在杂交分子的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物;或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可合成第二条链。,cDNA与载体的体外连接。,噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。,13,基因的化学合成,DNA 的合成,自 DNA 合成仪问世后，化学合成已可完全自动化，在半个小时内可合成 3035 个碱基的寡核苷酸。,目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150200 个核苷酸左右。,14,PCR 扩增技术的原理和应用,聚合酶链式反应（,polymerase chain reaction, PCR,），,是一种在体外快速扩增特定,DNA,序列的新技术。,15,如果,DNA,片段两端的序列是已知的，则先要合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的靶,DNA,片段的末端互补。,PCR,由,3,个基本反应组成。,变性,:,加热，模板,DNA,经热变性，成为两条单链；,退火,:,使温度下降，寡核苷酸引物即与模板,DNA,中所要扩增序列两端的碱基配对；,延伸,:,在适宜条件下引物,3,端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的,DNA,链。,DNA,片段以,2,的指数增长，重复,2530,次循环，扩增的,DNA,片段拷贝数可增至,10,6,-10,7,倍。,PCR 扩增技术原理,16,17,18,PCR 技术的实际用途, 可用于 DNA 的扩增和克隆，制备单链或双链 DNA 探针；也可用于定位诱变和 DNA 测序。, 在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分析确定。,用于法医,以鉴别个体和判定亲缘关系。,19,基因诱变,寡核苷酸介导的突变,盒式诱变,PCR,介导的突变,20,第三节微生物与克隆载体,载体,：克隆载体、表达载体、穿梭载体,克隆载体,：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以扩增外源DNA为目的载体，称为,克隆载体,。,21,克隆载体应具备的性质,1、可独立自主复制，具备复制原点；,2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。,3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。,4、具有一定安全性，在胞内不发生重组与转移，在胞外不发生不能自由扩散。,22,目前克隆载体种类,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13,噬菌体载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体。,23,一、质粒载体,1、特点：,（1）具有独立复制起点；,（2）具有较小的相对分子质量。1200kb，外源DNA15kb；,（3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终浓度1020g/ml，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成终止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝；,（4）具有便于选择的标记；,（5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞；,（6）具有限制酶单一识别位点。,24,pBR322的结构特征,环状双链,DNA,分子，由,4361bp,组成，松驰型,;,colE,复制起点，外源,DNA,大小为,5kb,左右,;,四环素抗性基因（,Tet,r,）、,氨苄青霉素抗性基因（,Amp,r,）,;,24,单一酶切位点（,Tet,r,中,7,个，,Amp,r,中,3,个）。,25,26,27,二、噬菌体克隆载体,28,噬菌体克隆载体的构建,野生型DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，插入片段至多为2.0kb，如果将其缩短便能够提高装载量。,插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天然的DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除,29,I 插入型载体,经改造后的长度为,37kb,，,为包装的下限，插入片段最大为,13.5kb,（,50.5-37kb,）,由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分组子与非重组子必须携带标记基因。,30,II 取代型载体,经改造后的长度约为,40kb,，,含两个酶切口，两者间的距离为,14kb,，,然后用外源,DNA,片段取代之。包装下限为,37kb,，,这类载体不需要标记基因，因为空载的载体,DNA,只有,26kb,，,不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。,31,噬菌体载体的优点,可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌,装载外源DNA的量大（23kb）,重组-DNA的筛选提取方便,噬菌体载体常用于构建基因文库。,32,三、 M13噬菌体载体,1、 M13 噬菌体基本特点：,（1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；,（2） M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 ；,（3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA ；,33,利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意义。,第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因调控的研究；,第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。,酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。,四、真核生物的克隆载体,34,1.酵母质粒载体,酵母质粒载体都是利用其2m质粒和其酵母染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。,主要有三种：附加体质粒、,复制质粒、整合质粒,35,（1）附加体质粒（episomal plasmid）, 结构：pBR322的复制起点、Ampr（氨苄青霉素抗性基因）；2m的复制起点；酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。, 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。,36,（2）复制质粒,含有：来自细菌质粒,pBR322,的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（,Ampr,）,和四环素抗性基因（,Tetr,）。,来自酵母染色体的自主复制序列（,ARS,）；,作为酵母选择标记的,URA3,基因和,TRP1,基因（色氨酸合成酶基因,1,）。,这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。,37,（3）整合质粒,含有：来自,pBR322,的复制起点；氨苄青霉素抗性基因（,Amp,r,）、,四环素抗性基因（,Tet,r,）。,来自酵母的,URA3,基因；它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体,DNA,进行同源重组。,这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体,DNA,的一个片段。,38,2.真核生物病毒载体,（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。,（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）；其次具有高表达效率（25）；安全，仅感染无脊椎动物；,（3）植物病毒载体,39,五、人工染色体,酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外源DNA片段。,1、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（telomere， TEL）、酵母自主复制序列（ARS）、选择性标记（如URA3）。,2、功能：大片段克隆（100万bp），多用于真核生物基因库的载体。,3、相关：细菌人工染色体（BAC）。,40,常用工具酶种类,内切酶,把DNA,长链切割为短的片段,连接酶,将2段DNA片段拼接起来,聚合酶,催化合成形成核酸链,末端转移酶,片段末端加接多聚核苷酸,核酸酶,水解酶，非专一性,反向转录酶,逆转录酶,第四节微生物与基因工程工具酶,41,一、限制性内切酶,1、限制性内切酶的定义,是指已被证明是限制修饰系统中的一个组成部分，具有识别双链DNA分子中的某种,特定核酸序列,并由此切割DNA双链结构的酶统称为,限制性内切酶。,42,限制性内切酶的发现,Luria,和,Human,发现细菌能将外来的,DNA,片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的,DNA,由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种现象叫做,限制修饰,。,Smith,和,Wilcox,从流感嗜血杆菌中分离到一种酶，能够特异性的切割,DNA,，,这个酶被命名为,Hind I,这是第一个分离到的限制性内切核酸酶。,43,44,45,3、限制性核酸内切酶的命名,按酶来源菌的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。,例如：从流感嗜血杆菌,d,株（,Haemophilus,influenzae,d,）,中先后分离到,3,种限制酶，则分别命名为,Hind,、,Hind,和,Hind,。,46,4、限制性内切酶的类型,限制性内切酶可分为三大类型：,类型I和类型III ：由于识别位点并非严格专一，很少被应用。,类型II的特点: 识别位点严格专一；识别序列的碱基数一般为4、6、8个bp；识别位点经常是一种回文序列的DNA；是DNA重组技术最为常用的工具酶。,47,寡核苷酸顺序具有二冲旋转对称轴，又称为,回文顺序,（,palindromic,sequence,）,GAA TTC,CTT AAG,也有一些对称顺序被一个或几个非特定的核苷酸间隔开。,N-,四种均可,Py,-,嘧啶,Pu,-,嘌呤,如,GTPyPuAC,Hind I,48,49,6、限制性内切酶的切割方式,就切割位点相对于对称轴的位置而言,切割方式有三种,:,在对称轴,5,侧切割产生,5,粘端,在对称轴,3,侧切割产生,3,粘端,在对称轴处切割产生平端,50,51,52,53,54,55,56,57,二、DNA连接酶,配对的碱基产生的氢键还不足以把两个,DNA,分子拴在一起，还需要通过,DNA,连接酶在,3,羟基和,5,磷酸基团之间形成新的,磷酸二酯键,。,大多数,DNA,连接酶都是从,T4,噬菌体中分离出来的，它可以催化在两条,DNA,链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两,条,DNA,链和末端都是平末端的两条,DNA,链,58,59,其它常用工具酶,60,61,3. Tag DNA聚合酶：是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5 3聚合酶活性，该酶最适反应温度为7580 ，主要用途是进行PCR反应。,62,4. 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）主要作用是将mRNA反转录成cDNA,63,（二）碱性磷酸酶,其作用是去除,DNA,、,RNA,的,5,磷酸根（,5-P,），,以防自身环化；另外在用,32,P,标记,5,末端前，可先用其去除,DNA,或,RNA,上的,5- P,64,（三）核酸酶,S1,核酸酶：主要用于去除,DNA,片段粘末端而产生平端；打开,cDNA,中发夹结构，使其成平端。,核糖核酸酶（,RNaseA,),：,在质粒提取时降解,RNA,；从,DNA-RNA,杂交体中去除未杂交的,RNA,区。,65,第五节 外源基因导入宿主细胞,66,二、克隆载体对宿主的要求,一、宿主的基本要求与性质,1、能够高效吸收外源DNA；,2、根据载体的类型和标记选择合适宿主，例： M13 噬菌体载体，选择含有F因子雄性大肠杆菌；,噬菌体载体，选择E.coliK12。,3、不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；,4、一般为重组缺陷型（RecA-）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；,5、安全：需严格限制载体的宿主范围，以达到尽量避免重组体从实验室逃逸出去。,67,1、外源DNA导入导入原核细胞,（1）转化和转染：外源DNA以重组质粒载体形式存在，则可通过转化导入原核细胞；外源 DNA构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒，则可通过转染方式进入 宿主细胞。,感受态细胞：用氯化钙处理宿主细胞，使细胞变得易于吸引外源DNA。,（2）DNA的侵染（体外包装转染技术）,体外包装（将重组DNA分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，组装成具感染力的噬菌体粒子）感染宿主。,较转染效率要高出10,4,10,5,倍。,三、外源基因导入宿主细胞,68,2、外源DNA导入真核细胞,（1）外源DNA导入酵母细胞（转化）,酵母细胞,原生质体,蜗牛酶,CaCl2和聚乙二醇,复合体（含DNA,的原生质体）,长出有壁细胞,再生培养基中,69,（2）外源DNA导入哺乳动物细胞,其中最简便的是微量注射法和电穿孔法。,（3）外DNA导入植物细胞,除了微量注射法及电穿孔法可将外源DNA导入植物细胞外。,还有两种方法，一种是基因枪法或称微弹枪法；另一种是将含有重组Ti质粒的根癌土壤杆菌与植物原生质体共培养（即共培养法）或与植物叶片培养（即叶片培养法）。,70,1. 载体选择标记的鉴定,(1) 抗生素平板法,(2) 插入失活法,(3) -半乳糖苷酶显色反应法,四、目的克隆的筛选与鉴定,71,抗生素平板法,缺点:,假阳性高,72,插入失活法,因外源 DNA 的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（ insertional inactivation ）,73,74, - 半乳糖苷酶显色反应法,兰,-,白斑筛选：某些载体，如,M13,，,PUC,系列，,PGEM,质粒系列等，都带有,lac,Z,基因的一段序列，编码,半乳糖苷酶的,肽；而宿主细胞为,Lac Z M15,的,突变株时，,肽可与,M15,进行,互补，产生具有活性的,半乳糖苷酶。,若将转化细胞涂布在含有异丙基硫代,-D-,半乳糖苷,(IPTG),和呈色物质,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-D-,半乳糖苷,(Xgal),培养基的平板上时，可形成蓝色菌落。,75,当外源,DNA,插入到这一区段，则会破坏,互补作用。这时若将转化细胞涂布在含有,IPTG,和,Xgal,培养基的平板上，则形成无色菌落。,76,77,2. 目的基因序列的鉴定,菌落（或噬菌斑）原位杂交（,in situ,hybridization,）,内切酶图谱鉴定,PCR,鉴定,78,菌落（或噬菌斑）原位杂交,将转化细胞培养在琼脂平板上，当形成菌落或噬菌斑后，再将硝酸纤维滤膜贴在平板上，使菌落或噬菌斑转印到硝酸纤维滤膜上。,翻转此滤膜并置于另一不含菌的平板上培养，培养后的滤膜上可长出菌落或噬菌斑。取出滤膜，用裂解液处理使菌体裂解，释放出,DNA,。,再用碱处理，使,DNA,变性，经烘烤将变性,DNA,固定于滤膜上。然后用放射性同位素标记的核酸探针进行分子杂交，并经放射自显影，黑点代表杂交上的菌落，即可筛选到阳性克隆。,79,80,内切酶图谱鉴定,将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体 DNA ，用 12 种内切酶酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入 DNA 片段大小。,81,双酶切鉴定重组质粒,82,DNA 序列测定,最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的 DNA 进行序列测定,83,84,表达产物氨基酸序列测定,一般分析,N-,末端（,15,个残基序列）和,C-,末端（一般,5,个）氨基酸鉴别蛋白质的性质和同质性；,85,第六节 外源基因在细菌中的表达,基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。,所谓表达载体（,expression vector,）,是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。,86,1. 启动子,（ promoter ）,启动子是指,RNA,聚合酶结合于,DNA,并起始合成,RNA,的一段,DNA,控制序列。,原核基因启动子位于转录起点（,transcription initiation,）,上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。,一 外源基因转录,87,原核表达系统中常用启动子, lac 启动子，是乳糖操纵子的启动子，受 lac I 编码的阻遏蛋白调节控制；, trp 启动子，是色氨酸操纵子启动子，受 trpR 编码的阻遏蛋白调控；, tac 启动子，由 lac 启动子的 -10 区和 trp 启动子 -35 区融合而成，汇合了 lac 和 trp 两者优点，是一个很强的启动子，同样受 LacI 阻遏蛋白调控 。, P(L 、 R) 启动子，是噬菌体左、右向启动子，其温度敏感的阻遏蛋白受温度调控；, T 7 噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多且十分专一，只被 T 7 RNA 聚合酶所识别。,88,2. 转录的调节和控制,通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中。这是由于某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细胞生长；,89,宿主细胞的生长和外源基因的表达应该分成两个阶段进行。,第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长直至获得足够量的细胞。,第二阶段是启动开关，使所有细胞外源基因同时高效表达，产生大量有价值的表达产物。,外源基因表达常采用化学物质诱导与温度诱导两种不同方法。,90,化学物质诱导,当用,lac,启动子构建表达载体时，,lac,启动子受,CAP,蛋白和,cAMP,的正调控。受阻遏蛋白的负调控；,当宿主细胞生长时，,lac,I,基因产生的阻遏蛋白与,lac,操纵基因结合，阻碍外源基因的转录和表达，此时细胞大量生长和繁殖。加入诱导物,IPTG,后，由于诱导物与阻遏蛋白结合，使其不能与操纵基因结合。于是，外源基因被诱导而高效转录和表达。,91,温度诱导,当用,PL,、,R,启动子构建表达载体时，,PL,、,R,启动子受,噬菌体,cI,基因的负调控，,cI,基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。,目前利用,cI,的温度敏感突变基因（,cI,857,ts,）调节这种阻遏。,当在,28-30,培养时，该突变体产生有活性阻遏蛋白，阻遏,PL,、,R,转录，细菌大量生长。,在获得足够量菌体后，使温度上升至,42,，造成阻遏蛋白失活，,PL,、,R,解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。,92,转录终止子,转录终止子指一段位于基因或操纵子的 末端，具有终止转录功能的特定 DNA 序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的 mRNA 过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨碍翻译的二级结构。,93,三 外源基因表达产物,为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子,ATG,的真核基因插入到合适的原核启动子和,SD,序列下游。,经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。,1. 非融合蛋白的表达,94,2. 融合蛋白的表达,所谓融合蛋白是指蛋白质的,N,端由宿主基因（通常只是,N,端的部分序列）编码，,C,端由外源基因编码的蛋白质，,换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。,95,3. 外源蛋白的分泌表达,分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。,通常信号肽与外源蛋白的,N,端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸和疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。,96,4. 包涵体,（ inclusion body ）,当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。利用大肠杆菌生产的非融合蛋白多数情况下以包涵体形式存在。,形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达和防止蛋白酶对其的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具生物学活性，需要体外复性。,97,第七节 基因工程的应用,基因工程药物,转基因植物,转基因动物,基因治疗,在微生物研究中应用,98,基因工程药品 胰岛素,胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每,100kg,胰腺只能提取,4,5g,胰岛素。,用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。,1979,年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌,DNA,分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。,1982,年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了,30%,50%,。,99,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。,传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每,300 L,血液只能提取出,1 mg,干扰素。,1980,1982,年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的,12,万倍。,1987,年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品 干扰素,100,基因工程药品 生长激素,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。,现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,101,基因工程药物的生产过程,1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。,2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子；,3、转化：重组DNA分子导入细胞。,4、筛选与鉴定；,5、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。,6、表达产物的纯化,102,转基因动物,转基因动物指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物,(,如鼠、兔、羊和猪,),的,受精卵,里，目的基因若与受精卵染色体DNA,整合,，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为。,103,104,转基因植物,1983,年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基因技术改良农作物的开始。,1986,年转基因农作物获得批准进入田间试验,;,1994,年美国,Calgene,公司培育的延熟保鲜的转基因番茄被批准商品化生产，,2000,年全世界转基因农作物的种植面积达,4,420,万公顷，发展速度非常迅猛。,105,106,小结,1. 基因工程，即DNA重组技术，是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的新兴技术领域。它的出现促使生物技术迅猛发展，改变了生物科学面貌，并带动了生物技术产业的兴起。,2. 基因工程的操作主要包括：基因的分离、合成和重组，基因的分子克隆，基因的测序和鉴定，基因的体外扩增和定位诱变，基因的表达等技术。,3. 基因克隆载体通常由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成，并需选择适当微生物作为克隆基因的宿主。微生物为基因操作提供了各种工具酶。,107,4. 微生物是常用的克隆和表达载体的宿主，可通过多种方法将载体导入宿主细胞；通过构建和筛选基因文库和cDNA文库可以获得目的基因，目的基因与载体连接后可以通过多种方法筛选获得重组体；,5. 原核表达载体的主要元件包括启动子、核糖体的结合位点、转录终止信号、密码子偏爱性等；,6. 聚合酶链式反应（ PCR ），是一种在体外快速扩增特定 DNA 序列的技术。通过基因定向诱变可构建不同的基因突变体；,108,谢 谢 ！,109,