机械搅拌罐培养大肠杆菌

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物发酵工程实验,环境与生物工程实验教学中心,1,实验六、机械搅拌罐培养大肠杆菌,一、实验目的,二、实验原理,三、实验材料,四、实验步骤,五、实验结果,六、注意事项,七、思考题,2,1、学会发酵参数的设置。 2、掌握发酵液参数的测定方法。,一、实验目的,3,微生物在发酵培养的过程中其体系参数会发生变化。本实验通过使用机械搅拌罐发酵培养大肠杆菌后测定其发酵液的菌体量、葡萄糖浓度、pH值。 采用分光光度计法在波长620nm下测定其浊度进行菌体量分析；利用pH计测定其pH值；葡萄糖浓度的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法，其原理为,3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。,二、实验原理,4,三、实验材料,1. 菌种：,大肠杆菌。,2.培养基：,种子活化培养基：,牛肉膏3g/L,；蛋白胨10g/L,； 氯化钠5g/L,；pH7.0-7.2,。,发酵培养基：,6g,/L,Na,2,HPO,4,，3g,/L,KH,2,PO,4,，0.5g,/L,NaCl，1g,/L,NH,4,Cl，0.5g,/L,MgSO,4,7H,2,O，0.011g,/L,CaCl,2,，10g,/L,葡萄糖, pH 7.0,。,3.,葡萄糖标准溶液和,3，5-二硝基水杨酸试剂。,5,四、实验步骤,（一）种子培养,用接种环从保存斜面中接一环至盛有种子活化培养基的三角瓶中，,37,振荡培养,。,（二）大肠杆菌的培养,调小气量，燃烧酒精，旋松接种口盖，在火焰保护下，打开接种口盖，倒入种子，旋紧接种口盖子。开始发酵，发酵条件为,35,、,300r/min,。每隔,2,小时取样。,6,（三）取样,每次取样时将管口先流出的,10ml,培养液作为废液，取随后流出的,20ml,。,（四）发酵结束处理,剩余菌液进行灭菌处理，排放到指定地点，进行罐的清洗。,四、实验步骤,7,（五）取样分析,1.,取样菌体量的分析：测定,620nm,浊度。,2.,葡萄糖浓度的测定：,3,5-,二硝基水杨酸比色定糖法（,DNS,法）,（,1,）标准曲线的制作,取九支试管，编号，按下表加入各种试剂。将各管快速摇动混匀，在沸水浴中加热,5min,取出后立即用水冷却到室温，再向每支试管中加入,21.5ml,蒸馏水,摇匀,于,520nm,波长测,A,值,以葡萄糖,mg,数为横坐标,光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。,四、实验步骤,8,（2）样品测定 取离心的上清夜稀释，取1ml于试管中，加蒸馏水1ml，加3,5-二硝基水杨酸试剂1.5ml，加完试剂后同以上操作，测定吸光值，在标准曲线上查出葡萄糖的含量，计算培养基中葡萄糖的量。,项目,0,1,2,3,4,5,6,7,8,1mg/ml溶液(ml),0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,葡萄糖量(mg),0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,蒸馏水(ml),2.0,1.8,1.6,1.4,1.2,1.0,0.8,0.6,0.4,3,5-二硝基水杨酸试剂(ml),1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,3. pH,值的测定,将不同时段取样离心的上清夜用,pH,计进行测量,观察发酵过程中,pH,值的变化,并以时间为横坐标,相应,pH,值为纵坐标作图。,9,(1) 以时间为横坐标，菌体数量，浊度，葡萄糖浓度，pH为纵坐标作图，观察各参数的变化。 (2)计算最大比生长速率和葡萄糖的比消耗速率。,五、实验结果,10,1.机械搅拌罐培养大肠杆菌接种和取样过程中应注意避免造成污染和正确使用设备。 2.注意正确使用离心机并注意安全。 3.酸度计的正确使用。,六、注意事项,11,七、思考题,机械搅拌罐在培养大肠杆菌的过程中和,发酵液参数的测定,要注意哪些问题？,12,