急性毒性实验内容

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,急性毒性试验方法,一、急性毒性,急性毒性指人或动物,一次,或,24 h,之内,多次,接触外源化学物后，在短期内所发生的毒性效应，包括致死效应。,一次：指瞬间给实验动物染毒，如经口、经静脉注射染毒。,24 h,之内多次：指外源化学物毒性过低，需给予动物较大剂量。,急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度与外源化学物的,性质,和染毒剂量的大小有关。,如：丙烯腈，过氧化二碳酸二环己酯,急性毒性试验目的,了解外源化学物急性毒性的强度，求出,LD,50,了解外源化学物毒作用的性质、毒效应的特征及可能的靶器官，初步评价外源化学物的危险性。,探求外源化学物的剂量,-,反应（效应）关系，为亚慢性毒性、蓄积毒性和慢性毒性及特殊毒性试验染毒,剂量的设计和观察指标的选择提供参考。,初步了解动物致死的原因，为研究毒作用的机制提供线索，进而为制定中毒急救治疗措施提供依据,。,由急性毒性试验可得到两类毒性参数,上限参数,是以死亡为终点的毒性，包括绝对致死量、半数致死量、最小致死量、最大耐受量等；,下限参数,是以非致死性急性毒作用为终点的毒性，包括急性阈剂量和无作用剂量等。,用小动物试验可求出外源化学物对一种或几种实验动物的急性,LD,50,或,LC,50,;,用大动物试验可求出,近似致死剂量,（,approximate lethal dose, ALD,）,;,根据,LD,50,（,LC,50,）,值可进行急性毒性分级，以初步评价外源化学物对机体急性毒性大小和急性毒作用的强度。,急性毒性试验项目,急性半数致死量测定,半数耐受限量测定,7d,喂养试验,其他：近似致死量试验、,固定剂量法、急性毒性分级法、阶梯法、金字塔法、限量试验、急性系统毒性试验等,。,急性毒性试验设计,实验动物选择,品种,品系,个体 性别 年龄 体重 生理病理状况,对外源化学物毒性反应与人近似；,易于饲养管理，方便实验操作；,易于获得，品系纯化，价格低廉。,原则,实验动物的年龄与体重的关系,动 物 大鼠 小鼠 豚鼠 兔 犬 猫,成年年龄（周）,3 2 2 34,34,34,体重（克）,150 15 250 1.5kg 715kg 1kg,寿命（年）,23,23,68 49 1520 1012,急性,毒性试验的动物体重,大鼠,120,150,小鼠,18,22,豚鼠,200,250,家兔,2,2.5 kg,犬,10,15kg,（成年）,变异范围不得超过所用动物平均体重的,10,。,急性,毒性试验的动物要求,动物数量：小动物,4,6,组，每组至少,10,只；犬等大动物每组,6,只。,性别：雌雄各半，也有例外，如，致畸试验的剂量准备，只作雌性动物,LD50,。,年龄：刚成年，未曾受孕、交配,实验,动物的标记,染色法,耳缘孔口法,烙印法,挂牌法,染色法,用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位来,表示不同号码，适用于大鼠、小鼠和豚鼠。,常用染料：,3,5,苦味酸酒精饱和液，呈黄色；,甲基紫酒精饱和液，呈紫色；,0.5,中性红或品红溶液，呈红色等。,实验,动物的标记,方法一：,按右前肢、右肋、右后肢、颈部、背中、尾根、左,前肢、左肋、左后肢，顺序编号为,1,9,号，不染色,为,10,号。在动物相同部位涂染另一种颜色染料表示,十位，两种颜色可编,1,99,号。,方法二：,以头部为,1,号，顺时针方向依次从右耳、右前肢、右,后肢、颈部、背中、尾根、左耳、左前肢、左后肢,染色，分别为,2,10,号。,6,染色法,优点：,简单方便，不痛苦，无损伤。,缺点：,时间较长时，染色剂易褪色；,标记容易模糊不清。,耳缘孔口法：,在耳缘先用针穿孔和用剪刀剪口，再用酒精墨汁涂抹，使黑色渗入孔口，伤口愈合后不易脱落，这种标号亦可标号。,适用于大、小鼠。,烙印法：,将铸铁号码加热后，在动物体表部位烧烙，以破坏毛囊，留下印记。适用于大动物。,挂牌法：,用金属或塑料制成号牌，固定在动物的耳部或系于其颈部。适用于较大动物。,实验动物分组,目的：,减少个体差异对实验结果的影响；原则：按统计学原则随机分组，使非处理因素最大限度地保持一致，提高每组实验动物间的均衡性。,常用方法：,完全随机,和,随机区组,完全随机设计,将实验动物编号，从随机数字表上任意横行或纵行的任意数字开始，顺序取下数字，标于每个动物号下，然后用计划组数去除随机数字，所得余数即为所属组别。如将只动物分为组，从随机数字表的第行开始，顺序取个数字，用除的余数即为组别。,20,只动物的完全随机分配,完全随机分配后各组所属动物号,20,只动物完全随机分配的结果,20,只动物的完全随机分配,动物编号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,随即数字,54,83,80,53,90,75,53,78,93,47,72,09,54,66,95,44,68,67,67,86,除,4,后余数,2,3,0,1,2,3,1,2,1,3,0,1,2,2,3,0,0,3,3,2,所属组别,二,三,四,一,二,三,一,二,一,三,四,一,二,二,三,四,四,三,三,二,完全随机分配后各组所属动物号,组别,动物编号,一,4,7,9,12,二,1,5,8,13,20,14,三,2,6,10,15,18,19,四,3,11,16,17,20,只动物完全随机分配的结果,组别,动物编号,一,4,7,9,12,19,二,1,5,8,13,14,三,2,6,10,15,18,四,3,11,16,17,20,随机区组设计,将动物称重，按体重顺序依次排列编号，分成若干个区组，每一区组的动物体重相近，每一区组的动物数即为组数。再从随机数字表上任意抄下随机数字，依次标在每个动物的编号下，如欲将动物分为组，则将每一区组动物编号下的随机数字，按顺序分别用、除之，根据余数大小将动物分入各组。,原则是余数即为所属组别，余数,0,属最后一组。当同一区组中有相同余数时，非,0,余数按顺序分配至未分配动物的首位组，而,0,余数则按顺序分配至未分配动物的末尾组。如下表第一区组中，第一个余数是,0,，将,1,号大鼠分到第,4,组；第,2,个余数为,1,，,2,号大鼠分到第,1,组；第,3,个余数仍为,1,，未分配动物的第,2,组居首位，故将,3,号大鼠分到第,2,组；余下,4,号大鼠则分到第,3,组。,优点：各组的动物数目相等，动物平均体重相近，可以减少实验误差；动物数目较多时比完全随机法快。,20,只小鼠按随机区组设计分组表,随机分配到各组的动物,剂量选择及分组,剂量选择,广泛查阅文献资料，估计毒性中值,预试，求出待测化学物,0 %100 %,或,10 %90 %,的大致致死剂量范围,设计正式试验的剂量和分组,剂量分组,i,lgLD100-lgLD0/n-1,或,i,lgLD90-lgLD10/n-1,n,：设计的剂量组数,i,：组距，相邻两个剂量组对数剂量,之差,受试物的配制,溶剂的选择,配制方法,等容量稀释,等浓度稀释,受试物的配制,等容量稀释：,要求不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同时，就将受试物配成不同浓度。等比稀释法（,1,：,k,）,等浓度稀释：,将受试化学物配成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积不同。,试验期限及观察指标,观察期限为,714d,求,LD,50,时，目前国内外一般要求计算实验动物接触外源化学物后,14 d,内的总死亡数,对于速发性死亡的化学物也可只计算,24 h,的死亡数，如久效磷,24 h,与,14 d,的,LD,50,没有差别,观察指标,中毒症状：确定靶器官, 行动：不安定、多动、发声；, 神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；, 自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸。,体重：隔日测量,死亡和死亡时间,病理学检查及其他指标,LD,50,的计算,LD,50,测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡呈正态分配时，一般具有以下特点：,剂量对数值与动物死亡频数之间为正态分布曲线关系；,剂量对数值与死亡率之间为正“,S”,型曲线；,从实验数据可计算,LD,50,以外的其它信息。,对数剂量,剂量,曲线：中间高、两侧低，右侧延长较远,正态曲线,中 点,中 点,计算,LD,50,的常用方法,:,概率单位法,Bliss,法,改良寇氏（,Krber,）,法等,LD,50,的计算公式,校正公式,LD50,的标准误,LD,50,的,95 %,可信限,LD,50,的,95 %,可信限,=log,-1,(log LD,50,1.96S,x50,),i,组距，即相邻两组剂量对数剂量之差,X,m,最大剂量对数,P,各剂量组死亡率,(,死亡率均用小数表示,),P,m,最高死亡率,q,各剂量组存活率，,q=1-p,P,n,最低死亡率,p,各剂量组死亡率之和,n,各组动物数,S,x50,logLD,50,的标准误,寇氏原法：要求最小剂量的反应率（,P,）为,0,，最大剂量反应率（,P,）为,100,，结果才精确。,改良寇氏法只要求在最小剂量时,P,0.2,，最大剂量,p,0.8,即可。还要求每个剂量组的组间距呈等比或剂量对数等差，每个剂量组动物数相等，中间剂量接近于,LD50,。,九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果,LD,50,=log,-1,0.8859-0.11(2.8-0.5),= log,-1,0.6329,=4.29,（,g/kg,）,S,x50,=0.0307,logLD,50,及其,95%,可信限,=0.63291.960.0307=0.63290.0602,小鼠的,经口,LD,50,为,4.29g/kg,，,其,95%,可信范围,为,3.744.93g/kg,急性毒性评价,外源化学物相对毒性分级标准,急性毒性分级（,WHO,）,鱼类急性毒性分级,LD,50,的局限性,消耗动物量大,获得的信息有限,动物死亡和观察的症状不足以反应生理学、血液学和其它化验检查所提供的毒性信息,有许多因素影响,LD,50,值的测定，实际上测得,的,LD,50,是近似值,LD,50,所表达的是,50%,动物存活与,50%,动物死亡的点剂量，是一个质的现象，而在实际工作中，往往发现有些外源化学物用同一物种、同一品系的实验动物、用相同染毒条件所得到的,LD,50,值相同或相似，但其毒作用带或致死剂量范围却有明显的不同，表明化学物的实际毒性存在差异。,急性毒性试验不等于,LD,50,测定,可用少量动物测定,ALD,，,并进行临床观察、化验检查和病理学检查,当口服剂量大于,5g/kg,或注射剂量大于,2g/kg,时，不产生急性毒性或死亡，则不必准确的测定,LD,50,FDA,认为评价外源化学物的急性毒性时，应在,LD,50,值之外加上,急性毒作用带,或其,斜率,进行综合评价，,LD,50,及其斜率在化学物的急性毒性评价中是必不可少的。,化学物急性毒性的报告应详细描述：,中毒症状及程度,出现症状的时间,死亡前的症状及死亡时间,存活动物的体重变化,死亡动物的病理变化,4,种不同外源化学物的毒作用带斜率比较,