基因工程的主要技术原理（教资优择）课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基础课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Genetic Engineering,第二章 基因工程的主要技术原理,1,基础课件,第二章,基因工程的主要技术原理,2,基础课件,由于提取,DNA,的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，,DNA,的提纯有很多方法。其中最常用的是,碱抽提法。,第一节,DNA,的提取与纯化,3,基础课件,4,基础课件,大肠杆菌基因组,DNA,5,基础课件,一、质粒,DNA,的提取,6,基础课件,plasmid DNA,The genomic DNA of,E. coli,: a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,7,基础课件,闭合环状的质粒,DNA,，在变性后不会分离，复性快；,（,1,）,原理,1 .,碱抽提法提取质粒,DNA,DNA,双链,变性,DNA,单链,复性,强碱,中性,闭合环状的质粒,DNA,，在变性后不会分离，复性快；,（,1,）,原理,1 .,碱抽提法提取质粒,DNA,DNA,双链,变性,DNA,单链,复性,强碱,中性,8,基础课件,染色体,线性,DNA,和或,有缺口,的质粒,DNA,变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质,SDS,复合物结合在一起，在离心的时候,沉淀,下去。,变性,9,基础课件,（,2,）,所用的试剂作用,溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分,肽聚糖,中的,-1,，,4,糖苷键,。,在碱性条件（,pH8,）下有活性。,葡萄糖,增加溶液的,粘度,，维持,渗透压,，防止,DNA,受机械力（震荡）的作用而降解。,（,2,）,所用的试剂作用,溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分,肽聚糖,中的,-1,，,4,糖苷键,。,在碱性条件（,pH8,）下有活性。,葡萄糖,增加溶液的,粘度,，维持,渗透压,，防止,DNA,受机械力（震荡）的作用而降解。,10,基础课件,EDTA,Mg,2+,、,Ca,2+,的螯合剂，可抑制,DNA,酶,的活性，防止,DNA,被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH,：,强碱，提供,pH12,的碱性条件，使,DNA,双链,变性,。,SDS:,溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成,“,蛋白,SDS”,复合物,，使蛋白质（包括,DNA,酶）变性沉淀。,11,基础课件,冰醋酸把醋酸钠溶液的,pH,调到,4.8,。,用来,中和,NaOH,变性液，使,DNA,复性。,高浓度的,NaAc,有利于变性的大分子（蛋白质、,DNA,、,RNA,等）沉淀。,用于,沉淀,DNA,。,乙醇,DNA,分子以,水合状态,“溶于”水里，乙醇能夺去,DNA,分子的水环境。,NaAc-HAc,缓冲液,12,基础课件,RNase A,降解,RNA,渣滓。,以免提取后的,DNA,中含有小分子的,RNA,。,TE,缓冲液,DNA,保存,液。,由,Tris-HCl,和,EDTA,配制。,Tris-HCl,不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；,EDTA,抑制,DNA,酶，防止,DNA,被酶降解。,13,基础课件,蛋白变性剂,，进一步抽提,DNA,溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。,但苯酚会残留在,DNA,溶液中。,（现多用各种商品化的,层析柱,纯化,DNA),。,酚,-,氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,14,基础课件,（,3,）碱抽提法提取质粒,DNA,的步骤,Solution I,的配制：,使用,“,溶液,”,溶解细菌细胞壁。,第一步：溶菌,50mM,葡萄糖，,25mM Tris-HCl(pH8.0),，,10mM EDTA,，,4-5mg/ml,溶菌酶,，,RNase A,15,基础课件,溶液,II,破坏细胞膜，蛋白质和,DNA,变性。,第二步：破膜，蛋白质和,DNA,变性,Solution II,的配制：,第三步：中和,溶液,III,使,DNA,复性、并促使蛋白质,-SDS,复合物和染色体,DNA,、,RNA,沉淀。,Solution III,的配制：,0.2N NaOH,，,1.0%SDS,3M,醋酸钠（用冰醋酸调,pH,至,4.8,）,16,基础课件,上清液中含有闭合质粒,DNA,。,第四步：离心除去沉淀,0.6,倍体积的异丙醇或,2,倍体积的,乙醇,。,第五步：纯化,DNA,上清液,过柱,或酚,-,氯仿抽提。,第六步：沉淀,DNA,17,基础课件,最重要的是：,2.,影响质粒,DNA,产量的因素,菌株的遗传背景，,质粒自身的拷贝数。,一般要使用,endA,基因,发生突变的大肠杆菌菌株。如,DH5,、,JM109,、,XL1-Blue,等。,（,1,）受体菌株,endA,基因编码,核酸内切酶,，,在,Mg,2+,的存在下可将双链,DNA,消化成,7bp,的寡核苷酸片断。,18,基础课件,这是直接决定,DNA,产量的重要因素之一。,（,3,）质粒大小,分子量大的质粒，拷贝数少。,（,2,）质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定,。,19,基础课件,若干常用质粒的理论产量,质粒名,分子大小,bp,拷贝数,质粒产量,g/ml,pGEM,pUC,pBR322,ColE1,pACYC,pSC101,2700,2700,4400,4500,4000,9000,300-700,500-700,25,15,10,6,1.8-4.1,2.9-4.1,0.32,0.15,0.09,0.12,若干常用质粒的理论产量,质粒名,分子大小,bp,拷贝数,质粒产量,g/ml,pGEM,pUC,pBR322,ColE1,pACYC,pSC101,2700,2700,4400,4500,4000,9000,300-700,500-700,25,15,10,6,1.8-4.1,2.9-4.1,0.32,0.15,0.09,0.12,20,基础课件,二、基因组或其他,DNA,的提取,一般过程及原理：,1.,细菌基因组,DNA,的制备,（,1,）细胞裂解,10%SDS,和蛋白酶,K,。,37,o,C,温育。,不用,NaOH !,21,基础课件,（,3,）沉淀,DNA,0.6,倍体积的异丙醇。,（,2,）,DNA,纯化,CTAB(,十六烷基三甲基溴化铵,),除去,多糖,，酚,-,氯仿,-,异戊醇除去,蛋白,。,22,基础课件,一般过程及原理：,动物组织剪成小块，置,液氮,中冻结后,研磨,成细粉末。,组织培养的细胞用,胰酶,消化松散后直接使用。,（,1,）组织粉碎,2.,哺乳动物细胞基因组,DNA,的抽提,23,基础课件,0.5%SDS,和,0.1mg/ml,蛋白酶,K,。,50,o,C,温育。,（,2,）细胞裂解,（,3,）纯化,DNA,用苯酚和酚,-,氯仿抽提除去蛋白质污染。,SDS,是离子型去垢剂（,detergent,），可以使细胞膜崩解。,（,5,）除去,RNA,污染,用,RNase,。,用,2,倍体积的无水乙醇。,（,4,）沉淀,DNA,（可以加入,1/10,体积的,3M,醋酸氨,辅助沉淀）,24,基础课件,一般过程及原理：,（,1,）组织粉碎,用,液氮,冷冻后,研磨,成细粉末。,3.,从植物组织中制备,DNA,（,2,）细胞裂解,用,2%CTAB/2-ME (,十六烷基三甲基溴化铵,/2,巯基乙醇）。,或,1% SDS,和蛋白酶,K,。,65,o,C,温育。,25,基础课件,用,0.6,倍体积的,异丙醇,（,-20,o,C,）。,（,3,）纯化,DNA,用苯酚和酚,-,氯仿抽提除去蛋白质污染。,（,4,）沉淀,DNA,（,5,）除去,RNA,污染,用,RNase A,。,（可以加入,1/10,体积的,3M,醋酸氨辅助沉淀） 。,26,基础课件,三、,DNA,的定量和纯度测定,1.,紫外光谱法,DNA,（或,RNA,）在,260nm,波长处有特异的紫外吸收峰。,用微量比色杯（,10,l,）在紫外分光光度计直接测定。,原理：,蛋白质在,280nm,处有吸收峰,27,基础课件,2,2,28,基础课件,溴化乙锭（,EB,）能插入,DNA,分子中，紫外光照射下能发,红色荧光,。,2.,琼脂糖凝胶电泳估计,原理：,与,已知浓度,的,DNA,电泳带荧光强度,对比,，就可以估计出,DNA,含量。,29,基础课件,一般使用琼脂糖凝胶电泳，与,已知分子量,的,DNA,标准混合液,对比,得知。,DNA,分子量,Marker,有许多公司的商品，使用非常方便。如,DNA,的,Hind,酶切物等。,四、,DNA,分子量的估计,Marker,Marker,30,基础课件,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,DNA Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp,DNA Marker,31,基础课件,C,Transcript levels of rice KNOX genes OSH1 and OSH3 revealed by RT-PCR in leaves from wild-type (WT), phenotypic YAB3 RNAi (Y1 and Y2), and WOX3 overexpression plants (W1 and W2). Shoot apex mRNA was used as a positive control (S).,32,基础课件,1.,带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质,相反的电极,移动，速度称为电泳迁移率。,2.,电泳迁移率同电场的,强度,和分子本身所带的,净电荷数目,成,正比,。,3.,电泳迁移率同分子与介质的,摩擦系数,成,反比,。,一、电泳的基本原理,第二节,DNA,的凝胶电泳,33,基础课件,4.,如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：,分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的,大小和形状,。,形状相似的分子的迁移速度主要与,分子量,相关,:,分子量越大，移动越慢。,摩擦系数主要与分子的,大小,、,形状,以及介质的粘度有关。,5.,34,基础课件,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的,DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，,线性分子次之，,伸展开环状最慢。,35,基础课件,36,基础课件,37,基础课件,Agarose gel electrophoresis,Gel electrophoresis,is not only used as an analytical method, it is routinely used preparatively for the purification of specific DNA fragments.,The gel is composed of:,Agarose:,for DNA fragments ranging in size from a few hundred base pairs to about 20 kb (Fig. 2.1).,Polyacrylamide,: for smaller DNA fragments.,38,基础课件,Fig. 2.1 Electrophoresis of DNA in agarose gels. DNA bands have been visualized by soaking the gel in a solution of ethidium bromide (see Fig. 2.2), which complexes with DNA by intercalating between stacked base-pairs, and photographing the orange fluorescence.,39,基础课件,Fig. 2.2 Ethidium bromide.,40,基础课件,Agarose gel,is a complex network of polymeric molecules whose average pore size depends on the buffer composition and the type and concentration of agarose used.,41,基础课件,In any event, gel electrophoresis is frequentlyperformed with marker DNA fragments of knownsize, which allow accurate size determination of anunknown DNA molecule by interpolation(,插入,).,In addition to,resolving DNA fragments of different lengths, gel electrophoresis can be used to separate different molecular configurations of a DNA molecule.,42,基础课件,Gel electrophoresis can also be used for,investigating proteinnucleic acid interactions,based on the observation that binding of a protein to DNA fragments usually leads to a mobility reduction.,43,基础课件,二,、琼脂糖凝胶电泳,1.,琼脂糖,2.,琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体,“,胨,”,。,是一种,线性多糖聚合物,，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。,浓度高,空隙小,44,基础课件,琼脂糖的浓度（,%,）,分离,DNA,的片断大小（,bp,）,0.3,0.7,1.4,500001000,200001000,6000300,空隙小，分辨率高：,小分子较易通过，而大分子难通过；,空隙大，分辨率低：,大小分子几乎以同等速率通过。,3.,琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,45,基础课件,1,、概述：,聚丙烯酰胺凝胶是由,丙烯酰胺（简称,Acr,）单体,和少量交联剂,甲叉双丙烯酰胺（简称,Bis,）,通过化学催化剂（,过硫酸铵），四甲基乙二胺（,TEMED,）作为加速剂或光催化聚合作用,形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。,三,、聚丙烯酰胺凝胶电泳,46,基础课件,优点是比琼脂糖凝胶的,分辨率高的多,。,聚丙烯酰胺凝胶浓度（,%,）,分离,DNA,片断大小（,bp,）,4.0,10.0,20.0,1000100,50025,501,三,、聚丙烯酰胺凝胶电泳,其优点是比琼脂糖凝胶的,分辨率高的多,。,聚丙烯酰胺凝胶浓度（,%,）,分离,DNA,片断大小（,bp,）,4.0,10.0,20.0,1000100,50025,501,琼脂糖凝胶电泳：,100050000bp,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,11000bp,47,基础课件,2,、聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）原理与装置,（,P,oly,a,crylamide,g,el,e,lectrophoresis,）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，,移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），,从而把不同分子量的肽链分开。,电泳,buffer,电泳,buffer,48,基础课件,电泳方向,49,基础课件,50,基础课件,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿,(,质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。,一克约为,6,10,23,道尔顿,3,、蛋白质电泳的分子量标准,51,基础课件,Dalton,SDS PAGE,52,基础课件,4,、,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：,灵敏度底、只能检出,0.3-1,g/,带，但可褪色回收。,硝酸银：,灵敏度高、可检出,2-5ng/,带。,2,）转到膜上进行染色。,1,）直接染色,53,基础课件,直接染色电泳结果,54,基础课件,四、凝胶染色,1.,染料,溴化乙锭。,E,thidium,b,romide,（,EB,）,55,基础课件,EB,是扁平分子，能,插入,DNA,碱基之间,，但不与琼脂糖结合。,EB,在,300nm,紫外光照射下能,发红色荧光,，即可显示,DNA,泳带在凝胶中所处的位置。,荧光强度与,DNA,含量及大小成正比。,2.,原理,56,基础课件,57,基础课件,58,基础课件,UVP,全自动凝胶成像分析系统,59,基础课件,OMEGA8-LOGO,全自动凝胶成像分析系统,60,基础课件,核酸杂交,是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为,DNA,印迹交（,Southern blot hybridization,）和,RNA,印迹杂交（,Northern blot hybridization,）。,第三节,核酸的分子杂交,61,基础课件,DNA-DNA,或,DNA-RNA,链杂交。用放射性同位素（,32,P,或,125,I,）标记的,DNA,或,RNA,探针。,62,基础课件,Southern,杂交的基本原理是将待检测的,DNA,分子用,/,不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的,DNA,或,RNA,探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。,一、,Southern blot,63,基础课件,Southern blot,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,DNA,样品,。,64,基础课件,65,基础课件,66,基础课件,Southern blot,筛选结果,67,基础课件,二、,Northern blot,用,DNA,（或,RNA,）探针检测,RNA,样品,。,在变性条件下将待检的,RNA,样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同,Southern Blot,相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录产物（,mRNA,）及其含量。,主要检测插入片断是否被转录。,68,基础课件,蛋白质印迹,(western blot),，又称免疫印迹,(immunoblotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。,Western Blot,基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。,Western Blot,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过,PAGE,分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。,三、,Western Blot,69,基础课件,Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、,PVDF,膜、中性尼龙膜等）。,Western,（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下,横向,转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,70,基础课件,Blotting,原理与,ELISA,相同。,待测蛋白,硝酸纤,维素膜,一抗,二抗,辣根过氧,化物酶,底物,产物，,并发出光,PAGE,胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：,HRPO,71,基础课件,72,基础课件,1,）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与,膜上的蛋白结合。,2,）洗去未结合的一抗。,3,）用二抗与一抗结合（,二抗上带有,HRPO,）。,4,）清洗掉未结合的二抗。,5,）用,HRPO,的底物浸泡膜。,6,）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting,过程,Immuno,Blotting,73,基础课件,结果,多克隆抗体,Blotting,的结果,单抗,blotting,结果,74,基础课件,四、,原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针。,75,基础课件,3,76,基础课件,第四节,基因,扩增技术,-PCR,一、基因扩增（,gene amplification),指生物体内或体外人工方式使基因,拷贝数大规模增加,。有下列五种方式：,1.,环境诱发扩增,2.,基因的程序性扩增,5. PCR,扩增,3.,基因组进化扩增,4.,基因工程扩增,77,基础课件,1.,环境诱发扩增,如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。,在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。,在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。,2.,基因的程序性扩增,如非洲爪蟾卵子形成过程中,rRNA,基因的扩增。,78,基础课件,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的,基因聚集成簇,。,5. PCR,扩增,应用聚合酶链式反应（,P,olymerase,C,hain,R,eaction,，,PCR,）技术，在体外特异性地扩增某个基因。,3.,基因组进化扩增,4.,基因工程扩增,载体,携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,79,基础课件,（,1,）,1. PCR,的发明,二、,PCR,技术,（,2,）,Mullis,由此获得,1993,年诺贝尔化学奖。,1985,年,Cetus,公司的科学家,K.B. Mullis,发明了,PCR,，使这一设想变成现实。,1971,年,Khorana,提出,体外人工复制,DNA,的设想。,当时由于,引物,和,DNA,聚合酶,及,DNA,测序,技术都没有解决，设想未能实现。,P,olymerase,C,hain,R,eaction,80,基础课件,81,基础课件,（,3,）,Taq DNA,聚合酶,1988,年,R.K. Saiki,把,Taq DNA,聚合酶用到,PCR,反应中。使,PCR,自动循环仪,成为可能。,（,4,）,PCR,仪,1988,年,Cetus,公司发明自动热循环仪。,1986,年,H.A. Erilish,从,嗜热,水生菌分离出,耐高温,的,Taq DNA,聚合酶，代替大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片断（,37,o,C ),，,PCR,技术才进入实用阶段。,82,基础课件,83,基础课件,PCR,仪,84,基础课件,2. PCR,技术的原理,模板,DNA,变性,引物,DNA,复性,引物,DNA,延伸,85,基础课件,双链,DNA,在,受热,后，配对碱基的氢键断裂，,DNA,两条链分开成为,单链,。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95,o,C,（,1,）,DNA,模板变性,模板,模板（,template,）,95,o,C,86,基础课件,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链,DNA,小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板,DNA,双链的,5,端相同,。,（,2,）,DNA,模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,ACGTACGTA,5,3,引物,引物,引物（,primer,）,:,40-65,o,C,87,基础课件,DNA,聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸,DNA,链。,（,3,）,DNA,链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72,o,C,88,基础课件,理论上,25-30,次循环就可以合成,2,25,-2,30,条,DNA,。,变性,复性,延伸。,（,5,）,1,个循环的结果,（,4,）新一轮循环开始,DNA,elongation,89,基础课件,3. PCR,的过程,（,1,）第一步,变性（,denature,）,94-95,o,C,下,5,分钟，模板,DNA,双链完全变性成单链。,（,2,）第二步,复性（,anneal,）,50-60,o,C,下,1,分钟，引物优先与模板复性。,引物的浓度高，,引物的链短。,90,基础课件,94,o,C,下,1,分钟，新合成的,DNA,双链又变性成单链模板。,（,4,）第四步,变性（,denature,）,72,o,C,下,1-2,分钟，,Taq DNA,聚合酶在引物的,3,端上加上核苷酸。,（,3,）第三步,延伸（,extend,）,（,5,）第五步,重复（,repeat,）,91,基础课件,第二步,第三步,第四步,复性,延伸,变性,95,o,C 5min,50,o,C 1min,72,o,C 2min,94,o,C 1min,温度循环,92,基础课件,PCR,仪的温度循环程序,93,基础课件,94,基础课件,PCR,95,基础课件,需要的模板量极低。,4. PCR,的特点,（,1,）特异性强,PCR,使用专门合成的,DNA,引物,。,延伸过程是在,高温,下进行。,（,2,）敏感性高,这就避免了一般,DNA,聚合酶污染和非引物延伸形成的,DNA,。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，,32,次循环就可合成约,10,9,条！,96,基础课件,RT-PCR,：,对模板的纯度要求低。,（,5,）可以扩增,mRNA,（,4,）简便,先用,逆转录酶,将,mRNA,合成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行扩增。,（,3,）快速,整个,PCR,过程约,4,小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,97,基础课件,自从,H.A. Erilish,分离出耐高温的,Taq DNA,聚合酶，代替大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片断（,37,o,C ),，,PCR,技术才进入实用阶段。,（,1,）,Taq DNA,聚合酶,5.,影响,PCR,的因素,Taq DNA,聚合酶的最大特点是,热稳定性,，耐高温，非常适合,PCR,过程的反复高温变性要求。,热稳定性,98,基础课件,最适温度：,75-80,o,C,延伸速度：,约,35-150nt/s.,酶分子,最长延伸长度：,6.7kb,最适温度高,Taq,酶的功能缺点,具有,5,3,聚合酶活性和,5,3,外切酶活性，但没有,3,5,外切酶活性。,因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过,600bp,长度的,DNA,就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,99,基础课件,金属离子敏感（尤其是,Mg,2+,）。,当,dNTP,（能结合,Mg,2+,）的浓度为,0.7-0.8mmol/L,时，,MgCl,2,的最佳浓度应是,2.0mmol/L,。,Taq DNA,聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl,也能激活,Taq DNA,聚合酶的活性。,4,金属离子敏感（尤其是,Mg,2+,）。,当,dNTP,（能结合,Mg,2+,）的浓度为,0.7-0.8mmol/L,时，,MgCl,2,的最佳浓度应是,2.0mmol/L,。,Taq DNA,聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl,也能激活,Taq DNA,聚合酶的活性。,4,100,基础课件,（,2,）其它耐热的,DNA,聚合酶,Tth DNA,聚合酶,无,3,5DNA,外切酶活性，但高温下能,逆转录,cDNA,，又能扩增,DNA,。,VENT DNA,聚合酶,有,3,5,外切酶活性，能够校正碱基的错配。,能耐受,100,o,C,高温,。,101,基础课件,Pfu DNA Polymerase,Taq Plus DNA Polymerase,有,3 -5,的外切酶活性，,5-3,外切酶活性。,但,PCR,产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温,DNA,聚合酶中出错率最低的。,是,Taq,和,Pfu DNA,聚合酶的混合物。,Taq,的,PCR,产物,3,端往往带有一个,A,。,102,基础课件,与待扩增的模板,DNA,区段的两,3,端序列互补,（,5,端相同,）的短,DNA,。,（,3,）引物（,primer),位置,3,3,103,基础课件,即,2.75,10,11,bp,的基因组中有一次完全与,19,个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约,2,10,-,11,）。,引物的长度,理论计算：,4,19,=2.75,10,11,。,一般引物设计为长,1530bp,。,104,基础课件,引物的碱基序列,5,端根据需要可设计成某个,内切酶的切点,顺序、,RNA,聚合酶识别序列,、,突变位点或生物素标记,等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3,GCTAGCTA,CTTAAG,5,3,端必须与模板正确配对，,5,端可以不配对。,template,primer,105,基础课件,尽可能提高,G+C,含量,，以提高引物与模板的结合力,;,引物的碱基组成,避免,连续相同碱基,排列或内部,回文序列,。,5,GGCAG,T,CTGCC,AGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1,）,2,）,106,基础课件,3,）避免,形成引物二聚体（,dimer,）。,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCA,GTC,TAC3,3,CAG,GACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,107,基础课件,引物的,Tm,值,Tm=,（,G+C),4 + (A+T),2,当引物中的（,G+C,）含量低于,50%,时，复性温度低于,55,o,C,。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择,低于,Tm,值,5,o,C,。,手工计算：,一般估计：,108,基础课件,引物的浓度,一般使用终浓度各,0.5,mol/L,。,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的,氨基酸序列反推出来的,，就必须考虑密码的简并性。,需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称,简并引物,。,109,基础课件,设计,多组引物,，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的,特异性,。,引物设计现在多用,专业软件,套嵌引物（,nested primers),1,3,2,4,如,Primer5.0,等,110,基础课件,Primer 5.0,111,基础课件,112,基础课件,113,基础课件,114,基础课件,115,基础课件,116,基础课件,117,基础课件,118,基础课件,119,基础课件,120,基础课件,121,基础课件,122,基础课件,123,基础课件,但不能有,蛋白质变性剂,、,DNA,酶,、,Mg,2+,的螯合剂,等影响,DNA,聚合酶的活性。,（,4,）模板（,template),模板的量：,不能太多,，,100,l,反应体系中,100ng,足够。,纯度：,PCR,对模板,DNA,的纯度要求不高。,124,基础课件,dNTPs,是,dATP,、,dTTP,、,dCTP,和,dGTP,的总称。,（,5,）,dNTPs,一般反应体系中,dNTP,s,混合液终浓度用,0.2mmol/L,。,浓度过高会抑制,Taq DNA,聚合酶的活性并增加错配率。,125,基础课件,Taq DNA,聚合酶要求有游离的,Mg,2+,。,（,6,）,Mg,2+,的浓度,所以,Mg,2+,浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。,一般用,1.5-4.5mmol/L,的,MgCl,2,终浓度。,126,基础课件,借助于,荧光信号,来检测,PCR,产物。可以做到,PCR,每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定,CT,值，从而根据,Ct,值,确定起始,DNA,的拷贝数，做到真正意义上的,DNA,定量。,6. PCR,技术的扩展,（,1,）荧光实时定量,PCR,Realtime PCR,（或,TaqMan PCR,）,Ct,值：,样品到达域值水平所经历的,循环数。,127,基础课件,扩增两个,引物外侧,的未知序列,（,2,）反向,PCR,把线性,DNA,模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统,PCR,只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,128,基础课件,使引物的外侧序列,“,转变,”,成内侧序列。,129,基础课件,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链,DNA,。最后产物中,99%,是单链,DNA,。,（,3,）不对称,PCR,3,5,5,3,引物少,用于扩增,单链,DNA,，单链,DNA,更适于测序。,技术关键：,两个引物的浓度相差,100,倍。,130,基础课件,扩增,RNA,模板。如,mRNA,或,RNA,病毒。,（,4,）反转录,PCR,（,RT-PCR),Temin,H.,发现反转录酶，,1975,诺贝尔奖,技术关键：,利用,反转录酶,，把,RNA,反转录成,cDNA,，再以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增。,131,基础课件,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq,酶,PCR,Reverse transcription (RT),下游引物,上游引物,Taq,酶,132,基础课件,Fig. 3.,RT-PCR analysis of,Gbd 1,and,Gbd 2,in,Pima 90,following infection by,V. dahliae,after 0, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 and 96 h, respectively. M: 100 bp DNA ladder. his-3 of cotton as the control.,133,基础课件,7. PCR,技术的应用,（,1,）扩增某一段,DNA,从基因组中扩增；,从载体上扩增；,组织样本原位扩增；,微量残留,DNA,扩增；,分析模板序列；,134,基础课件,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（,2,）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的,5,端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（,2,）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的,5,端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（,2,）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的,5,端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,135,基础课件,设计引物定点诱变,136,基础课件,利用,6bp,长度的,随机序列引物,扩增细胞中的总,DNA,，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。,（,3,）基因组的比较研究,比较不同物种之间的基因组特征和相似性。,类似于限制性内切酶片断长度多态性（,RFLP,）分析，因而也称为,随机扩增多态性,DNA,（,RAPD,）分析。,RAPD (,R,andom,a,mplified,p,olymorphism,D,NA,),137,基础课件,1970,年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速,DNA,序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：,当时没有能把不同长度的,核苷酸片断分离开,的技术。,当时的分析思路局限于,RNA,序列分析法。,第五节,DNA,序列分析,（,1965,年,Cornell,大学的,S.W. Holley,等首次测定了,75bp,的酵母丙氨酸,tRNA,全序列。使用的是降解片断法）。,5,138,基础课件,Sanger,等,1977,年发明。,一、双脱氧链终止法,Frederick Sanger, 1980,年,Nobel Prize,化学奖,139,基础课件,（,1,）,DNA,复制是以一条链为模板，按,碱基配,对,的原则进行的。,（,2,）脱氧核糖的连接是以,3,5,磷酸二脂键,。,（,3,）复制反应可以在,体外,进行。,（,4,）,2,和,3,双脱氧的,ddNTP,会使复制反应终,止。,1.,原理,140,基础课件,141,基础课件,142,基础课件,（,1,）制备单链,DNA,模板,2.,技术要点,就是待测序的,DNA,链。,不能有,5,3,和,3,5,的外切酶活性；,与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。,（,3,）特殊的,DNA,多聚酶,dNTP / ddNTP = 100 / 1,（,4,）制备,2,和,3,双脱氧的,ddNTP,时, DNA,电泳带谱的分离效果最好，可读出,200,多个核苷酸序列。,143,基础课件,需带有,放射性或荧光标记,。,（,2,）制备一小段单链引物（,DNA,或,RNA,）,144,基础课件,3. Sanger,双脱氧终止法测序过程,145,基础课件,146,基础课件,模板序列,147,基础课件,1977,年，哈佛大学的,A.M. Maxam,和,W. Gilbert,发明。,二、,Maxam-Gilbert,化学修饰法,Walter Gilbert, 1980,年,Nobel Prize,化学奖,148,基础课件,末端放射性标记,的,DNA,片单链,长度只差一个核苷,酸的,DNA,链混合物,化学试剂处理,凝胶电泳,放射性自显影,阅读碱基顺序,特定的碱基中,引入化学基团,DNA,在被修饰的,核苷酸位置断裂,1.,原理,149,基础课件,碱基,特异修饰方法,G,pH8.0,用硫酸二甲脂对,N7,进行甲基化，使,C8-C9,键对碱基裂解有特殊敏感性,A+G,pH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的,N,原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键,C+T,肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去,C,在,1.5mol/L NaCl,存在时，可用肼除去胞嘧啶,2.,碱基特异的化学修饰法,150,基础课件,反应,切割,碱基修饰,修饰碱基的转移,DNA,链的断裂,R1,GA,硫酸二甲脂,pH7.0,加热,氢氧化钠,R2,AG,硫酸二甲脂,酸,氢氧化钠,R3,C+T,肼,六氢吡啶,六氢吡啶,R4,C,肼,+,盐,六氢吡啶,六氢吡啶,R5,G,硫酸二甲脂,六氢吡啶,六氢吡啶,R6,G+A,酸,酸,六氢吡啶,R7,C+T,肼,六氢吡啶,六氢吡啶,R8,C,肼,+,盐,六氢吡啶,六氢吡啶,R9,AC,氢氧化钠,六氢吡啶,六氢吡啶,R10,GA,硫酸二甲脂,pH7.0,加热,六氢吡啶,R11,G,亚甲蓝,六氢吡啶,六氢吡啶,R12,T,四氧化锇,六氢吡啶,六氢吡啶,3.,碱基特异的化学切割法,151,基础课件,4.,测序过程,152,基础课件,每组反应只针对特定的碱基，共有,4,组反应，可分别显示,G,、,A+G,、,C,、,C+T,的终止位置。,特点：,读出的序列就是要测的序列。,Sanger,测序法读出的序列是,新合成,的互补链序列。,153,基础课件,154,基础课件,155,基础课件,测序读片,156,基础课件,90,年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的,4,个科学家小组同时提出来的。,1.,原理,（,1,）只有完全互补的,DNA,序列才能杂交形,成完全的双链分子。杂交效率最高。,三、,DNA,杂交测序,（,2,）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。,（,3,）非互补碱基越多，杂交效率越差。,157,基础课件,（,4,）用一段寡居聚苷酸（,8-mer,）的,所有可能的碱基排列序列,作探针。,8mer,探针有,4,8,= 65536,种序列。,如：,8-mer,靶,DNA,同,65536,中的,一种,探针完全杂交形成,完全互补,双链。,（,5,）根据,杂交效率,可推断出靶,DNA,的序列。,5-AGCCTAGC-3,Target,3-TCGGATCG-5,Probe,假如探针序列已知，则可推知靶,DNA,序列。,158,基础课件,但：,12mer,靶,DNA,与,8-mer,探针杂交，将会有,5,种,探针与之形成完全互补双链。,3-TCGGATCG-5,3-CGGATCGA-5,3-GGATCGAC-5,3-GATCGACT-5,3-ATCGACTT-5,5-AGCCTAGCTGAA-3,12-mer target,8-mer probe,假如知道能与之完全杂交的所有,5,种探针序列，就可推知,12bp,的靶,DNA,序列。,159,基础课件,（,1,）,DNA,芯片（,chip,）,把寡聚核苷酸探针的,3,端或,5,端与玻璃或凝胶形成共价连接。,目前可以做出,65536,种,8-mer,探针芯片。,2.,技术要点,每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。,160,基础课件,161,基础课件,DNA chip,杂交,162,基础课件,（,1,）非放射性标记,1981,年第一台商业化生产的,DNA,自动测序仪诞生。,四、,DNA,自动化测序,荧光物质标记。用激光能激发出,不同颜色的荧光。,1.,技术要点,（,2,）不同的标记对象,既可标记,引物,，也可标记,ddNTP,。,163,基础课件,（,4,）分析自动化,（,3,）读片的自动化,激光探头直接读胶，实时阅读。,（,2,）反应的自动化,Sanger,脱氧终止法。,电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出,DNA,序列。,（,5,）反应可在一个试管中进行,标记,ddNTP,时。,164,基础课件,2.,荧光标记引物的自动化测序,分别用,4,种荧光物标记,引物,，,区分反应产物，,混合,电泳，,激光一次,读胶，,电脑,合成结果。,165,基础课件,166,基础课件,3.,荧光标记,ddNTP,自动测序原理图解,4,种不同的荧光物分别标记,4,种,ddNTP,。,167,基础课件,可在同一管中进行,168,基础课件,可在单一泳道电泳。,169,基础课件,荧光标记终,止法测序,170,基础课件,测序结果,171,基础课件,毛细管测序仪,日本开发的世界上最高速,DNA,测序仪。可同时解析,384,个样品！,标记法：,4,色荧光、引物标记,/,终端标记。,测序长度：,600bp/,毛细管,6,毛细管测序仪,日本开发的世界上最高速,DNA,测序仪。可同时解析,384,个样品！,标记法：,4,色荧光、引物标记,/,终端标记。,测序长度：,600bp/,毛细管,6,172,基础课件,第六节,酵母双杂交系统,Yeast Two Hybrid System (Interaction trap),90,年代，纽约大学的,S. Field,等建立。,173,基础课件,Constructed three set of test recombination Plasmids into yeast(,双因子杂交系统,),GAL4 activation domain,Lex DNA-binding domain,GAL1 operator,Lac Z as reporter,UAS,G,GAL1 operator,Lac Z as reporter,GAL1 operator,Lac Z as reporter,LexA,enhancer,1,、双因子杂交试验：,174,基础课件,GAL1 operator,Lac Z as reporter,UAS,G,GAL1 operator,Lac Z as reporter,GAL1 op