lecture06

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,6,章 重组产物的表达纯化与,分析,本章内容,大肠杆菌表达系统；,真核表达系统；,表达产物的分离纯化策略；,蛋白质标签技术；,多肽链拼接技术在分离纯化表达产物中的应用；,表达产物的分离与鉴定,DNA,重组技术用于表达蛋白产物,DNA,重组技术的重要应用之一即是用于在细胞中过表达某种蛋白，以方便地获得大量该种蛋白；,可以进行蛋白结构与功能研究；,或者是作为一种有用成分，为人们服务；,表达外源基因的总的要求,将外源基因置于强启动子的调控之下；,最好是诱导表达；,要保证产物稳定,(,不被降解,),；,要保证便于分离、纯化；,要保证产物能获得正确的高级结构和活性,(,正确折叠,),；,表达载体最能体现外源基因表达技巧,表达载体应当具有克隆载体的要求：有复制起点、有筛选标记、有合适的,MCS,等；,还应当有驱动外源基因的合适的启动子、转录终止子（如细菌,rrnB,rRNA,操纵子的,T1T2,串联转录终止子等,）以及必要的转录或翻译增强元件等；,1,、,大肠杆菌表达系统,优点：菌体繁殖快，培养基便宜，其基因表达系统研究透彻，外源蛋白表达量高，因此是重组蛋白生产的首选体系；,缺点,1,：没有,RNA,转录后拼接系统，不能进行翻译后修饰,(,糖基化、甲基化和磷酸化等,),，并且容易在胞内形成包含体；,缺点,2,：含有对人有害的大肠杆菌内毒素，在制备重组药物时，必须设法从纯化表达产物中去除。,启动子强度、载体性质、翻译起始区,RNA,的二级结构、密码子偏爱性、,mRNA,稳定性和表达产物的稳定性,(N,末端规则,),等；,启动子：选择强启动子；,核糖体结合位点,：,SD,序列与,16S,rRNA,3,末端互补程度；,AUG,与,SD,序列间的距离；,mRNA,二级结构及其稳定性。,表达效率的影响因素,大肠杆菌表达系统的启动子,能与,RNA,聚合酶结合起始以转录的一段,DNA,序列；,具有保守的元件：,-10,序列，,-35,序列；,另外还有一些与反式因子结合的特殊序列，对基因转录进行激活或抑制，以实现基因调控；,常用的细菌启动子,P,Lac,：取自大肠杆菌,Lac,操纵子，受,Lac,阻遏蛋白负控，受,IPTG,的诱导；,P,Trp,：取自大肠杆菌,Trp,操纵子；,P,Tac,：,Lac,启动子和,Trp,启动子的杂合启动子；,P,L,和,P,R,启动子：来自噬菌体的强启动子，受,噬菌体,cI,基因负调控，温度诱导；,T7,启动子及表达系统；,常用的细菌启动子及特性,取自大肠杆菌,Lac,操纵子，受阻遏蛋白,Lac I,负调控；,特点：受,IPTG,的诱导，在诱导表达时不能用葡萄糖作碳源物质（,CAP,的作用）；,缺点：驱动表达能力不高，且在无诱导时也存在少量表达；,后一问题可以通过对阻遏蛋白的编码基因进行改造得到改善（如,lac,I,q,突变体,lac,I,表达被提高，因而增强了无诱导时对启动子的抑制）；,A,、,L,ac,启动子,(The,lac,Promoter,P,Lac,),B,Tac,启动子,(The,tac,Promoter,P,Tac,),Lac,启动子与,Trp,启动子进行“杂合”得到的启动子；,将,P,Lac,的,-35(TTTACA),序列换成,P,Trp,-35(TTGACA),;,综合了,Lac,与,Trp,启动子的优点：能被,IPTG,诱导并且转录起始效率大约提高到,5,倍，使表达蛋白的量占到细菌总蛋白的,20-30%;,而且：,P,tac,不受,CAP,的影响（葡萄糖不会抑制诱导）；,C The,P,L,Promoter：P,L,原来是位于,噬菌体基因组上的左侧启动子，其阻遏蛋白为,cI,基因编码的蛋白；,cI,的突变型,cIts857,在,30,时,可以阻遏启动子，在,42,阻遏作用解除；,因此借助于该启动子及阻遏蛋白可以实现外源基因的温度诱导表达；,优点：热诱导不用添加外来的诱导物，成本低；缺点：但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。,大肠杆菌表达载体,pBV221,的图谱,D T7,表达系统,利用,T7,噬菌体的,RNA,聚合酶来驱动外源基因的转录；,T7,噬菌体的,RNA,聚合酶（,T7,噬菌体,1,基因编码）为一条多肽链（与大肠杆菌,RNA,聚合酶,2,不一样）,；,表达宿主菌基因组有,P,lac,启动下的,1,基因，表达载体有,P,lac,启动下目的基因，并且还有一个表达,T7,溶菌酶的辅助表达载体；,典型例子：,Novagen,公司的,pET,表达系统；,Novagen,公司的,pET,的特点,目标基因被克隆到不为大肠杆菌,RNA,聚合酶识别的,T7,启动子之下，因此无,T7 RNA,聚合酶期间没有表达发生,(,关闭完全,),；,重组质粒转移到基因组内有由,lacUV5,控制的,T7 RNA,聚合酶基因的表达宿主中，如果加入,IPTG,诱导表达可提供,T7 RNA,聚合酶，,T7 RNA,聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达；诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的,50%,；,http:/,pET,其他特征,提供各种不同融合标签和表达系统配置,可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌；,许多载体以,LIC,载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆,PCR,产物,许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性,pFORCE,TM,克隆系统具有高效克隆,PCR,产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。,枯草杆菌的优点,枯草杆菌是非致病土壤微生物，严格生长在有氧条件下，不像大肠杆菌那样具有热源脂多糖；,枯草杆菌遗传学现在相当发达，有很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体；,作为革兰氏阳性菌，具有单层细胞膜结构。当分泌蛋白跨过细胞膜后，就被加工和直接释放到培养基中，这使得回收和纯化蛋白较为简单,(,很多商业酶是芽孢杆菌产生的胞外蛋白,),；,芽孢杆菌可大量产生几个商品酶，如,淀粉酶、蛋白酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等，因此，发酵技术相当成熟。,问题与方向,用芽孢杆菌表达了很多酶，取得厂很大进展，有的已商业化，产生了很大的社会和经济效益。,存在的问题主要是质粒的稳定性和蛋白酶，对前者，主要办法是将克隆基因整合到染色体。,今后能在以下几个方面会有进展： 扩大芽孢杆菌工程菌表达和生产酶的种类； 提高质粒的稳定性，包括分离性和结构性的稳定性； 利用多个调控基因和诱导等方法提高表达量； 将已有的工业用菌株改建成为工程菌等方面。,酵母：操作方便，有转录及翻译后加工能力；,昆虫细胞：具有高等真核生物表达系统的优点，产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但糖基化的程度较低，形式单一；,哺乳动物细胞系统：产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后加工修饰最准确，但表达水平较低；,2,、,真核系统,酵母表达系统,用来进行外源基因表达的酵母菌有：粟酒裂殖酵母,(,Schizosaccharomyces,pombe,),啤酒酵母（,Saccharomyces,cerevisiae,） 和,毕赤酵母（,Pichia,pastoris,）,等；,A,啤酒酵母（,Saccharomyces,cerevisiae,）,可用的组成型启动子有,PGK, GPD,和,ADH1,；,诱导性启动子：,GAL,系统和,CUP1,系统；,组成型启动子有,PGK, GPD,GAL,系统,GAL,系统涉及酵母菌半乳糖的糖异生过程；,编码有关酶的基因（,GAL,基因）都受一个共同的激活蛋白,Gal4p,调控，每个,GAL,基因的启动子上都有至少一个,Gal4p,的,结合位点；,葡萄糖抑制,Gal4p,基因的转录，其他非半乳糖的存在使,Gal80p,结合于,Gal4p,的,转录激活结构域，妨碍激活转录；,外源基因表达效率低；,GAL,系统：将半乳糖转变为,G6P,，,进入糖酵解,CUP1,系统,利用酵母对过量铜（,Cu,2+,和,Cu,+,）的,解毒机制；,过量的铜对细胞有害，过量的铜与金属调节蛋白,Ace1p,结合，导致后者与,CUP1,基因的转录调控位点结合，激活其转录，,CUP1,编码金属硫蛋白，该蛋白络合过量铜，避免毒性；,该过程反应灵敏，但关闭“不严”。,B,毕赤酵母系统（,Pichia,pastoris,）,毕赤酵母可以甲醇为唯一碳源生长；,利用甲醇的第一步：分子氧将甲醇氧化为甲醛，由乙醇氧化酶催化，由于该酶对,O,2,亲和力较低，因此需要大量酶分子参与催化；,甲醇诱导乙醇氧化酶（,AOX1,）,表达，该过程效率高，其启动子为强诱导型启动子，可以用于驱动外源基因表达；,该系统最大特点表达效率高（,0.5-10g/L,），,且蛋白糖基化更接近于高等真核细胞。,毕赤酵母表达载体的结构,高等真核细胞表达系统,在,昆虫细胞中表达；,在哺乳动物细胞中表达；,需要精心设计基因表达诱导系统。,利用多角体病毒,(NPV),表达,核型多角体病毒,(nuclear,polyhedrosis,viruse,简称,NPV),是研究得最早和最为详细的一类昆虫病毒。,到,1986,年，国内外发现,464,株，中国约,124,株，其中,78,株为首次发现。,在分类上为杆状病毒属（,Baculovirus,）的,A,亚组。,核型多角体病毒,(NPV),一般形态特征：,具有较大的包涵体，称为多角体,(,polyhedra,),，在被感染的细胞核内形成。,多角体大小常因寄主昆虫种类的不同而不同，甚至在统一寄主细胞内，多角体的形状大小也有区别。,杆状病毒表达系统,当今基因工程四大表达系统之一，与细胞、酵母、哺乳动物细胞表达系统相比，,BEVS,具有以下许多优点：,1,）较大的杆状病毒的核衣壳和基因组，一次可以容纳大至,12 kb,的外源基因片段；,2,）应用晚晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使产物对细胞或虫体有毒性，仍可得到高水平的表达产物，因为表达在大部分病毒粒形成后才启动，而此时细胞的翻译、转录机构已被病毒所控制，细胞对表达产物毒性的敏感性明显降低。,3,）杆状病毒对脊椎动物无病原性，也未有能在哺乳动物细胞内进行病毒,DNA,转录，长期滞留，有效复制或将其基因整合到哺乳动物细胞基因组内的报告，因此，,BEVS,可以被认为遗传学七是安全的表达载体。,4,）昆虫细胞作为较高等真核细胞能完成表达产物的一系列翻译后加工修饰，绝大部分外源基因产物均显示良好的生物活性。后加工包括糖基化，脂肪酸酰基化作用，氨基末端等。,5,）昆虫杆状病毒表达载体一般均使用,polH,或,p10,强启动子，很多外源基因均可得到超高效表达。最近发现有些,BEVS,的表达产物在昆虫细胞内具有结晶现象，这在表达产物的纯化、分类、蛋白品体形成生长及结晶体特征研究具有十分重要意义；,6,）家蚕核型多角体病毒（,BmNPV,）,-,家蚕表达系统，则更具有宿主饲养容易，成本低廉，加之家蚕已丧失野外生存能力，环境扩散的可能性小，遗传背景清楚，形体大，发育快，每毫升血淋巴的表达量达一毫升悬浮细胞的表达量高,10,倍左右的超高表达量。家蚕没有与人畜共患的疾病，也不存在许多哺乳动物细胞系可能含有的潜在致癌转化元件；,7,）可构建多元表达系统。,可以构建多元表达系统,借助于多元表达载体或几个不同的重组病毒共同感染可以同时表达多个外源基因，优点：, 构建带有选择标记的重组转移载体，加快重组病毒的筛选。, 同时表达两个或多个外源基因，如用双表达载体表达抗体的轻链和重链基因，并能在昆虫细胞内正确装配成有功能的抗体蛋白；, 构建多效价杀虫剂的重组病毒，提高和加速杀虫效果；, 用多元载体表达多个病毒外壳蛋白基因，重组病毒感染昆虫细胞后，可正确装配成不具感染性的空壳病毒，而对重组空壳病毒作为脊椎动物的灭活疫苗具有很大的应用潜力。这点对生产基因工程抗体不具感染性的空壳蛋毒基因工程疫苗和研究肽超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能提供了一个有用的工具。,BAC-TO-BAC expression system.,3,、蛋白分离纯化：标签（,tag,）,技术,表达产物的分离纯化可以通过蛋白各种性质来进行：带电荷、疏水性、分子大小；,采取相应的层析技术来分离,(,离子交换、凝胶过滤、疏水层析等,),；,但是蛋白性质有时相近，蛋白质种类又极多，许多种蛋白质的分离都非常烦琐；,蛋白的纯化标签技术可以使多种目标蛋白以相同的方式分离纯化出来；,His-tag,设法使表达产物在序列的某个位置插入连续的几个,His,残基，由于,His,残基对某些金属,(,如镍,),具有特殊的亲和力，借此分离纯化；,通常是将,6,个,His,置于产物的,N,端或,C,端，以防止对蛋白质结构、功能产生不利影响；,如果确信表达产物中间的某个部位对功能没有影响，也可以置于中间,;,特点：,His tag,在,pH8,时不带电、对蛋白折叠、活性、免疫原性无影响，可以不切除标签进行一些后续研究。,氨基三乙酸,(NTA),上柱与洗脱：,1,、,pH,值高到低；,2,、咪唑低到高；,3,、不加与加,EDTA,GST-tag,谷胱甘肽,-S-,转移酶,(GST),与谷胱甘肽之间的高亲和力，标签（融合表达）后过一结合了谷胱甘肽的亲和柱，融合蛋白就会吸附，最后用高浓度的谷胱甘肽就可洗脱下融合蛋白；,GST“,标签”影响产物结构，需要除去；,一般通过在融合处设计特意某些蛋白酶识别位点，借助于蛋白酶水解掉标签；,蛋白酶特异性不好可能会破坏目的蛋白。,MBP-tag,外源基因重组到,malE,编码序列的下游，,malE,编码麦芽糖结合蛋白（,MBP,）；,MBP,融合蛋白可以与直链淀粉结合，之后用麦芽糖洗脱；,去标签新技术：,IMPACT,Intein,mediated purification with an affinity chitin binding tag,(IMPACT) is an approach to protein purification that uses the protein self-splicing of,inteins,to remove the purification tag and give pure isolated protein in one chromatographic step.,Inteins,are a class of proteins, found in a wide variety of organisms, that excise themselves from a precursor protein and in the process,ligate,the flanking protein sequences (,exteins,).,NEB,的,IMPACT,系统,The IMPACT System utilizes an,intein,(454 amino acid residues) from the,Saccharomyces,cerevisiae,VMA1 gene.,A target protein is fused to a self-cleavable,intein,tag in which a chitin binding domain allows affinity purification of the fusion precursor on a chitin column. In the presence of,thiols,such as DTT, -,mercaptoethanol,or,cysteine, the,intein,undergoes specific self-cleavage which releases the target protein from the,chitinbound,intein,tag resulting in a,singlecolumn,purification of the target protein,3,、表达产物的分离与鉴定,基因克隆的最终目的是希望外源基因能在原,(,真,),核生物中获得快速、高效表达，并能很方便地分离纯化得到纯品,;,鉴定和分离纯化表达产物的步骤基本程序包括培养细胞、诱导表达、破碎细胞、收集粗提取物、纯化等；,由于产物表达形式,融合或非融合；分泌或胞内；胞内不可溶,(,包涵体,),或胞内可溶,不同而有所差异；,又由于产物性质,(,疏水性、半衰期等,),千差万别，造成分离、纯化和鉴定上情况比较复杂。,大肠杆菌表达产物的分析,融合蛋白,融合表达的一个最大的好处，就是可以利用融合伴侣制备亲和载体，很容易将表达的融合产物与大肠杆菌蛋白分离开；,如果需要与融合伴侣分开，只要在被亲和载体吸附时，用特异的断裂水解酶或试剂将融合部位断裂，即可纯化表达蛋白。,融合表达产物的分离,例子：带,His-tag,的产物的亲和层析纯化,分泌型产物的分离,包含体的纯化和复性,大肠杆菌高表达的重组蛋白质常形成包含体，即以变性蛋白的形式在胞內聚集，这种变性蛋白质的量可高达总蛋白质量的,95%,；,以包含体形式存在的蛋白质分子不具有正确的三维结构,(,天然结构,),，它们在水溶液中通常不溶解且没有活性，,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白质的重大损失；,包含体分离纯化则比较简单，但需要有一个简单而有效的复性策略和方法，从包含体中获得具有生物活性的重组蛋白质。,包含体复性问题非常复杂，不同蛋白具有不同性质，可能需要采用不同方法来解决，往往没有一定之规；,常用的复性方法有：稀释法、透析法、凝胶过滤法、亲和层析法，或者加分子伴侣帮助重组蛋白重新正确折叠等等。,包涵体复性,一般包涵体可以先使用温和变性剂（如：低浓度的尿素）和去污剂（如：,Triton-X100,）将包涵体初步洗涤，之后用,8M,尿素将包涵体溶解；,有人尝试当蛋白挂在柱子上的时候，在还原和氧化的谷胱甘肽存在的情况下用浓度从,6M,到,0M,的盐酸胍过柱，促使蛋白的折叠。在蛋白重新折叠后用咪唑洗脱。,蛋白质电泳,(SDS-PAGE),：,聚丙烯酰胺凝胶电泳法。利用诱导表达前后蛋白质区带对比，通常可以观察到表达产物区带的位置和染色深浅，可以初步判断表达蛋白的分子量以及表达量的多少；,免疫特异性鉴定：利用特异性抗体对表达蛋白进行鉴定，如荧光抗体法、免疫沉淀法、,ELISA,、免疫印迹法（,Western blotting,）和点印迹,(Dot blotting),等等。由于抗体的高特异性，可判断表达蛋白的真实性（是否存在移码突变）；免疫印迹法可以在,SDS-PAGE,后直接进行，不必对表达蛋白作任何纯化处理，是一种常用的鉴定方法；,产物活性鉴定：表达产物是否有天然产物的活性，是验证基因克隆是否成功的关键。,例子：,SOD,和,EFE,例如：对于含有,SOD,（超氧化物歧化酶）样品在电泳后，利用,NBT,（氮蓝四唑）作为底物进行染色，含有,SOD,的电泳区带会出现蓝色；,对于,EFE,：如果凝胶中加入纤维蛋白或酪蛋白，则电泳后经过适当的温浴，可以在纤溶酶区带处出现透明带，与蛋白质染色的凝胶对照，可以很方便地得知活性区带的位置，通过扫描还可以获得表达蛋白在总蛋白的百分含量；,参考文献,萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南,(,第三版,.,中译本,),科学出版社，,2002,李育阳，基因表达技术，科学出版社，,2001,