第四章核苷酸和核酸

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第,四,章 核苷酸和核酸,核酸的发展和研究简史,1868,Friedrich,Miescher,核素,1889,R.,Altmann,核酸,1909,Levene,、Jacobs,酵母核酸中的,D-,核糖,1929,Levene,、Jacobs,胸腺中的,D-2-,脱氧核糖,1953,Watson、 Crick DNA,的双螺旋结构,1956,Konberg,DNA,聚合酶,1958,Crick,中心法则,1961,Jacob、,Monod,操纵子学说,1966,Nirenberg,破译遗传密码,1970,Nathans,限制性内切酶,1981,Cech,核酶的发现,1990,启动人类基因组计划,Completion of a working draft, June 26, 2000.,HGP leaders and President Clinton announce the completion of a working draft DNA sequence of the human genome.,Biology entered a brave new era, the Age of Genomics,.,2002,年2月12日，历时年的人类基因组机会最终完成，报道了的人类基因组序列，从这时候起，生物学进入了后基因组时代（,post genomic era)，,人类基因的研究由测定,DNA,序列，解释遗传信息的传递转移到从分子整体水平上对生物功能的研究，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘，包括蛋白质组学，功能基因组学，药物基因组学等。,2006,年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁菲尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了,RNA,干扰,现象。,年诺贝尔化学奖授予美国科学家罗杰科恩伯格，以奖励他在“真核转录的分子基础”研究领域作出的贡献。,2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国的马里奥-,R-,卡佩奇、奥利弗-史密斯和英国的马丁-,J-,伊文思，以奖励他们在胚胎干细胞和“基因打靶”研究方面所做的贡献。,核酸的种类及功能,单链,DNA：,某些病毒,DNA,环状双链,DNA ：,质粒、细菌,线状双链,DNA：,真核生物,mRNA,RNA,tRNA,rRNA,DNA,主要的遗传物质,RNA,参与蛋白质的生物合成,某些病毒的遗传物质,肺 炎 球 菌 转 化 实 验,碱基,嘧 啶,嘌呤,碱基、核苷和核苷酸,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,尿嘧啶,核苷：,核苷碱基戊糖,核糖,脱氧核糖,碱基和戊糖的结合方式,H,H,H,H,嘌呤核苷,嘧啶核苷,核苷酸,嘌呤核苷酸,嘧啶核苷酸,核苷酸,：,AMP, GMP, UMP, CMP,脱氧核苷酸：,dAMP,dGMP,dTMP,dCMP,具有信号及调控作用的核苷酸,辅 酶,A,核苷酸参与构成的重要化合物,稀 有 碱 基,2-,核苷酸和,3-,核苷酸的混合物,RNA,在碱溶液中的水解,核酸的共价结构,文字式：,pApCpGpTpA,pACGTA,碱基的性质：,异构化,内酰胺,内酰亚胺,双内酰亚胺,DNA,双螺旋中的碱基对氢键形式,核酸的紫外吸收,增色效应，减色效应,DNA,的 双 螺 旋 结 构,Rosalind Franklin,DNA,的,X-,射线衍射图,20,世纪40年代后期，,Erwin,Chargaff,通过对各生物碱基组成分析，提出了重要的,Chargaff,定则：,(1),A=T,(2)G=C,(3)A+G=T+C,DNA,双链的方向,双链,DNA,的俯视图,通过对碱基组成特点及,DNA,结晶的,X,光衍射分析,1953年，,Watson,和,Crick,提出,DNA,双螺旋结构模型,。,特点：,(1)两条链反平行相互缠绕的右手螺旋，螺旋上有大沟(,major groove),和小沟(,minor groove)。,(2),碱基在内侧，磷酸和核糖在外侧。,(3)螺旋直径2,nm，,相邻碱基距0.34,nm，,每圈10（10.5）对碱基，螺距3.4（3.6）,nm。,(4),A,与,T,配对,，形成2个氢键；,G,与,C,配对，形成3个氢键。,(5),DNA,双螺旋结构稳定的力主要是氢键（横向) 和碱基堆积力（纵向）。,B-DNA,A-DNA,Z-DNA,三种双螺旋,DNA,类型的比较,A,型,B,型,Z,型,螺旋手性,右手性,右手性,左手性,分子形态,较平滑双螺旋,平滑双螺旋,Z,字形扭曲,螺旋直径（,nm）,2.6,2.0,1.8,碱基对,/,螺旋,11,10.5,12,碱基对上升高度,(,nm),0.26,0.34,0.37,碱基倾角,20,o,6,o,1,o,糖苷键构象,反式,反式,嘌呤顺式,嘧啶反式,碱基排列方向,朝内,朝内,外露,凹槽,大沟（窄、深）,小沟（宽、浅）,大沟（宽、深）,小沟（窄、浅）,一种沟（小沟、窄、深）,稳定存在条件,较高离子强度，相对湿度,75,DNARNA,杂交体,低离子强度，细胞中,DNA,的构象,嘌呤嘧啶相间排列,特殊的,DNA,碱基顺序：回文顺序和镜像重复顺序,（,回文顺序）,具有回文顺序的,DNA,可以形成“发夹”或“十字”形结构,具有镜像对称顺序的碱基易于形成三链,DNA (H DNA),Hoogsteen,配对,RNA,的结构,单链,RNA（,rRNA,）,因为分子内部的碱基配对形成的二级结构，无配对的碱基形成“突起”或“环”。,3 - end,5 - end,16s,rRNA,的二级结构,tRNA,的二级结构,和三级结构,tRNA,的,三叶草形,二级结构,tRNA,的倒,L-,形三级结构,mRNA,的结构,单顺反子,mRNA（,monocistronic,mRNA）,与多顺反子,mRNA（,polycistronic,mRNA）:,原核生物的,mRNA,仅为一条肽链编码，称为单顺反子,mRNA；,为两条以上肽链编码则为多顺反子,mRNA,。,hnRNA,内含子,(,intron,),mRNA,真核生物,mRNA,成熟过程：,外显子,(,exon,),核酸的变性、复性及杂交,核酸的变性,在某些理化因素作用下，,DNA,双链解开成两条单链的过程称为变性。,变性后理化性质变化：,OD,260,增高,粘度下降,浮力密度升高,生物活性丧失等等,RNA,和,DNA,的熔解温度曲线,DNA,的,Tm,值与,G-C,含量的关系,(G+C)% = (Tm - 69.3) 2.44,退火,:,变性的,DNA,经缓慢冷却后可复性，这一过程称为退火。,淬火,:,热变性,DNA,溶液温度迅速降至0,o,C，DNA,单链失去碰撞机会，不能复性，此种冷处理过程称为淬火。,不同来源的单链核酸依据分子的互补性形成双螺旋的过程称为分子杂交。利用分子杂交技术，可以用设计的,DNA,探针钓出特殊的,DNA,顺序或基因。,DNA,的杂交,核酸的复性,：,影响复性的因素：冷却的快慢，,DNA,的浓度，,DNA,的复杂程度,复性的快慢以,C,o,t,1/2,(K，,分子的复杂度),来表示，表明,DNA,复性反应的初始浓度与反应完成一半所需时间的乘积是个常数。,K,随,DNA,分子量的增加而增大。,核酸的化学反应：,碱基的脱氨基作用:,碱基的环外氨基的丢失,C: 10,-7,/24,A/G: 10,-9,/24,2.,核酸的脱嘌呤作用：,10,-,/24,DNA,的突变,紫外线的诱导,DNA,链上的胸腺嘧啶二聚体,化学诱变剂,脱氨基试剂：亚硝酸类化合物,烷化剂：,SAM,二甲基硫酸酯等,超氧化物：,H,2,O,2,等,DNA,的酶法甲基化,SAM,介导的甲基化系统,Dam,甲基化酶介导的甲基化：5,G,A,TC 3,DNA,的甲基化有调控基因表达的作用。,核酸的酶解,核糖核酸酶,专一性核酸酶,脱氧核糖核酸酶,牛脾磷酸二酯酶,非专一性磷酸二酯酶,蛇毒磷酸二酯酶,RNase,I,RNase,T1,RNase,T2,DNase,I,DNase,II,核酸外切酶：蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶,核酸内切酶,a,b,核酸的限制性内切酶,1962,年发现细菌中含有特异的核酸内切酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化而避免水解，而外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了,限制一修饰,体系，其功能就是保护自身的,DNA，,分解外来的,DNA，,以保护和维持自身遗传信息的稳定。这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。,II,类限制性核酸内切酶,特点：,只由一条肽链构成，,作用不需,ATP，,仅需,Mg,2+,，,不进行甲基化或其他化学修饰；,作用位点有4或6个核苷酸残基，作用位点具有回文结构，得到粘末端或平末端。,产生5突出粘性末端,:,以,EcoR,I,为例：,5,G,AATT C3 5,Gp,HO,TTAA,C3,3C ATAA,G5 3C,TTAA,OH,pG,5,产生3突出的粘性末端：以,Pst,I,为例：,5,CTGCA,G3 5,C,TGCA,p,HO,G3,3G,ACGTC5 3G,OH,p,ACGT,C,5,产生平末端,：,以,Nru,为例：,5,TCG,CGA3 5,TCG,p,HO,CGA,3,3AGC,GCT5 3,AGC,OH,p,GCT,5,限制性酶切图谱：,各种限制性内切酶在某一,DNA,分子或,DNA,片段上切点的排列，各酶切位点之间的距离以碱基对数目表示。也称物理图。,限制图的制作：,对,DNA,链的一端进行放射性同位素标记,单酶切,琼脂糖凝胶电泳,切点数各片段分子量,双酶切,琼脂糖凝胶电泳,DNA,一级结构的测定：双脱氧末端终止法,DNA,的酶促合成,条件：,模板,引物,四种,dNTP,DNA,聚合酶,Sanger,末端终止法原理：,把聚合反应分四组 ， 每组加入一种,2，3,双脱氧核苷三磷酸。它随机地掺入到合成的,DNA,中，一旦掺入，,DNA,的合成就终止，所以加入有,2，3,双脱氧腺苷酸,(,ddATP,),的那一组所有的片断均是以,ddATP,为3,末端，其余类似。,双脱氧末端终止法,核酸自动测序仪的原理,DNA,的超螺旋,正超螺旋：,螺旋过份，即每圈螺旋的碱基对数目小于10.5;,负超螺旋：,螺旋不足,即每圈螺旋的碱基对数目大于10.5;,负超螺旋可以形成两种不同的状态,天然,DNA,都以负超螺旋的形式存在。负超螺旋易于形成,“,泡状,”,结构，有利于,DNA,的复制、重组和转录等功能,。,超螺旋数：,Lk ,Wr,+,Tw,Wr,：,超螺旋数（,Lk,，,螺旋轴的缠绕数）,L,k,：,拓扑连系数（拓扑旋转数）,Tw,：,螺旋数（,L,k0,BDNA,螺旋数）,对一个含有210,bp,的环形闭合,DNA,分子，,T,210 / 10.5 = 20,如果从中解开2个超螺旋，则,L,k,18，,超螺旋数,Wr, L,k,T,18-20 = -2,超螺旋密度,2/20 = -0.1,细胞中,DNA,的超螺旋密度一般为-5%-7%.,