2色谱学导论

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 色谱分析方法导论,1,概述,历史、色谱分离过程、分类,2,色谱学基本概念,色谱图及相关术语,3,色谱法基本原理,描述分配过程参数、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述,(,塔板理论及速率理论,),4,分离度及色谱分离方程,分离度及色谱分离方程、影响分离的因素,茨维特实验（动画,m4-1-1.swf,）,2.1.1,色谱法由来,:,1903,年，俄国植物学家,Mikhail,Tswett,最先发明,色谱柱,流动相,固定相,色谱法,2.1,概述,1940,年，,Martin,和,Synge,提出了液液分配色谱法,1941,年，,James,和,Martin,发表了从理论到实验比较完整的气液色谱法，获得了,1952,年的诺贝尔化学奖,20,世纪,60,年代，高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现,HPLC,20,世纪,80,年代，毛细管超临界流体色谱（,SFC,）得到发展,2.1.2,色谱分离基本原理,：,当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱也有差异，因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同次序从固定相中流出。,与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,样品,载液,检 测 器,色谱图,2.1.3,色谱分类方法：,A.,按固定相外形分：,柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱） 。,B.,按组份在固定相上的分离机理分：,吸附色谱,(,adsorption chromatography,):,不同组份在固定相的吸附作用不同；,分配色谱,(,partition chromatography,),：,不同组份在固定相上的溶解能力不同；,离子交换色谱,(,ion-exchange,),：,不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；,凝胶色谱（,尺寸排阻色谱,gel,chromatograhy,）：,不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。,C.,按两相状态分,分类,方法,固定相,平衡类型,气相色谱,气液色谱,气固色谱,气相键合色谱,液体吸附于固体,固体吸附剂,有机组分键合于固体表面,气液间分配,吸附,气体和键合体表面间的分配,液相色谱,液液色谱,液固（吸附）色谱,液相键合色谱,离子交换色谱,凝胶渗透（尺寸排阻）色谱,液体吸附于固体,固体吸附剂,有机组分键合于固体表面,离子交换树脂,液体附于多空聚合物,不相溶液体间的分配,吸附,液体和键合体表面间的分配,离子交换,分配,/,筛析,超,临界流体,有机组分键合于固体表面,超临界液体和键合相间的分配,2.2.1,色谱流出曲线（色谱图,chromatogram,）,混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应,2.2,色谱学基本概念,色谱图,是柱流出物通过检测器产生的响应信号对时间或流动相流出体积的关系曲线图。它反映分离的各组分从色谱柱洗出浓度随时间的变化，从一个侧面记录下组分在柱内运行的情况。,1,）,基线,：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，,S/N,大的、稳定的基线,应该是一条水平直线，如图中,CD,线。,基线漂移,(,Baseline drift,):,指基线随时间的缓慢变化；,基线噪声,(,Baseline noise,):,指由各种因素所引起的基线起伏。,单一组分色谱图,2.2.2,色谱术语,2,）,峰高,：,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（,h,）表示。,3),色谱峰面积,(peak area),色谱峰面积就是色谱曲线与基线间所包围的面积，即图中,CBD,内的面积。,4),色谱峰区域宽度,(peak width),用来衡量色谱峰宽度的参数，有,三种表示方法,：,（,1,）,标准偏差,(,)：,即,0.607,倍峰高处色谱峰宽度的一半。,（,2,）,半峰宽,(,Y,1/2,),：,色谱峰高一半处的宽度,Y,1/2,=2.354,（,3,）,峰底宽,(,W,b,),：,W,b,=4,信号,进样,t,0,5,）,保留值,(Retention value, R),（,定性参数）,表示试样中各组分在色谱柱中的滞留时间的数值。,组分在色谱系统中的保留值，有三种描述方法：,第一，用,时间,描述组分保留行为的参数；,第二，用,流动相的体积,描述组分保留行为的参数；,第三，用,相对值,描述组分保留行为的参数。,死时间,(Dead time, t,0,),：,不与固定相作用的物质,从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。据,t,0,可求出流动相平均流速：,(2-1),b.,保留时间,t,r,：,试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间,t,0,和组份在固定相中滞留的时间,t,r,。,信号,t,r,t,0,进样,c.,调整保留时间,：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即,(2-2),由于时间为色谱定性依据，但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。,d.,死体积,V,0,：,色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：,(2-3),其中，,F,0,为柱出口的载气流速,（,mL,/min),e.,保留体积,V,r,：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。,V,r,=,t,r, F,0,(2-4),f.,调整保留体积,V,r,：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。,(2-5),注意,：,r,2,1,只与,柱温和固定相性质,有关，而与柱内径、柱长,L,、填充情况及流动相流速无关。具体做法：固定一个色谱峰为标准,s,，然后再求其它峰,i,对标准峰的相对保留值，此时以,表示：,1,又称选择因子,(Selectivity factor),。,g.,相对保留值,r,2,1,：,组份,2,的调整保留值与组份,1,的调整保留值之比。,(2-6),(2-7),色谱流出曲线的意义,：,色谱峰数,=,样品中单组份的最少个数；,色谱保留值,定性依据；,色谱峰高或面积,定量依据；,色谱保留值或区域宽度,色谱,柱分离效能评价指标；,色谱峰间距,固定相或流动相,选择是否合适的依据。,2.3,色谱法基本原理,两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的,热力学,性质决定。,每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程,动力学,性质决定。,因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。,2.3.1,、描述分配过程的参数,（,1,）,分配系数,(Distribution constant,) K,：,分配系数是由组分和固定相的,热力学,性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。,(2-8),一定温度下，组分的分配系数,K,越大，出峰越慢；,试样一定时，,K,主要取决于固定相性质；,每个组份在各种固定相上的分配系数,K,不同；,选择适宜的固定相可改善分离效果；,试样中的各组分具有不同的,K,值是分离的基础；,某组分的,K,= 0,时，即不被固定相保留，最先流出。,（,2,）,分配比,(Retention factor or capacity factor, k),：,又称,容量,因子,。表示一个组分在固定相中停留的时间是不保留组分保留时间的几倍。,其中,V,m,色谱中流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积。,V,s,为固定相体积。,分配比,k,的求算：,k,= (t,r, t,0,) / t,0,= t,r,/ t,0,= V,r,/ V,0,(2-9),(2-10),t,R,=t,0,(1,k),推导过程见下：,若流动相（载气）在柱内的线速度为,u,，即一定时间里载气在柱中流动的距离（单位,cms,-1,),，由于固定相的作用（保留），所以组分在柱内的线速度,u,s,将小于,u,，则两速度之比称为滞留因子（,retardation factor,）,R,s,.,R,s,=u,s,/u,（,2-11,）,R,s,可用质量分数,表示：,组分和流动相通过长度为,L,的色谱柱所需时间分别,（,3,）,K,与,k,的关系：,称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。,选择因子,：色谱柱对,A,、,B,两组分的选择因子,定义如下：,A,为先流出的组分，,B,为后流出的组分。, 与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，而与柱尺寸、流速、填充情况无关,注意：,K,或,k,反映的是,某一组分,在两相间的分配；,是反映,两组分间,的分离情况！,(2-17),1.,塔板理论（,Plate theory),Martin,塔板理论假定：,1,）塔板之间不连续；,2,）塔板之间无分子扩散；,3,）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度,H,；,4,）,某组分在所有塔板上的分配系数相同；,5,）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。,当塔板数,n,较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数,n50,时，峰形接近正态分布。,H,2.3.2,峰间距、峰形状和峰宽的理论描述,根据呈正态分布的色谱流出曲线,可以导出计算塔板数,n,的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：,若柱长为,L,，,则每块理论塔板高度,H,为,但上述两式包含死时间,t,0,，,它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常,以有效塔板数,n,eff,和有效塔板高度,H,eff,表示：,塔板理论的局限性,(1),蒸馏塔不完全符合色谱柱内情况（假设理想）；,(2),不是跳跃式脉冲而是连续的；,(3),在一个塔板高度内，也达不到瞬时平衡，需要一定时间传递；,(4),不能找出影响塔板高度的内在因素；,(5,）,峰形为什么会扩张？,2.,速率理论（,Rate theory,也称范,.,弟姆特方程式,）,1956,年，荷兰化学工程师,van,Deemter,u,为流动相线速度；,A,，,B,，,C,为常数，其中,A,表示涡流扩散系数；,B,分子扩散系数；,C,传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。,任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低,H,，,从而提高柱效。,1,）涡流扩散项,(Multipath term, A),展宽程度以,A,表示：,A=2d,p,其中,d,p,填充物平均直径；,填充不规则因子,。,可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小,A,，,提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即,A=0,。,2,）分子扩散项,(,Longitudinal diffusion term, B/u,),也叫纵向扩散相。,它是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进， “塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为,B=2D,称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；,D,组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以,D,g,或,D,m,表示；,讨论,：,：,固定相颗粒使分子扩散受阻，因此降低扩散程度,分子量大的组分，,D,g,随柱温升高？，随柱压降低而？；,流动相分子量大，,u,增加，,对于液相色谱，因,D,m,较小，,B,项可勿略。,球状颗粒；,大分子量流动相；适当增加流速；,短柱；,低温。,D,g,小，即,B,小,D,g,小，即,B,小,组份停留时间短，纵向扩散小；,（,B/u,）,传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，产生峰形展宽。,a,）,气液色谱,：传质阻力项,C,包括气相传质阻力系数,C,s,和液相传质阻力系数,C,l,。,流动相,固液界面,固定液,组分分子,C,l,C,g,3,）,传质阻力项,(Mass-transfer term, Cu),b,）,液液色谱,：传质阻力项,C,包括流动相传质阻力系数,C,m,和固定相传质阻力系数,C,s,。,sm,涡流扩散项,A,与流速,u,无关；,低流速区,(,u,小,),，,B/u,大，分子扩散项占主导，,此时选择分子量大的气体如,N,2,和,Ar,为载气，可,减小扩散，提高柱效；,高流速区,(,u,大,),，,Cu,大，传质阻力项占主导，,此时选择分子量小的气体如,H,2,和,He,为载气，,可增加扩散系数，提高柱效；,曲线的最低点对应最佳线速,u,opt,( ),下的,最小板高,H,min,( ),；,LC,的,H,min,和,u,opt,均比,GC,的小一个数量级，即在,LC,中，较低流速可获得较大的柱效。,4,）流速,u,由,van,Deemter,方程,H = A + B/u + Cu,知道：,当,u,一定时，仅在,A,、,B,、,C,较小时，,H,较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。,以,u,对,H,作图，可得,H-u,曲线（如图），从该曲线得到：,板高，,H(cm),H,min,A+B/u+Cu,C,m,u,C,s,u,A,B/u,2.4,分离度及色谱分离方程,2.4.1,分离度,(Resolution, R),分离度是定量描述相邻两组分在色谱柱内分离情况的指标。同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。,R,越大，相邻组分分离越好。,R,=0.8,：两峰的分离程度可达,89%,；,R,=1,：分离程度,98%,；,R,=1.5,：达,99.7%,（相邻两峰完全分离的标准）。,R=1.5,R=0.75,R=1.0,响应信号,保留时间,t/ min,讨论：,色谱分离中的四种情况的讨论：, 柱效较高，,K,(,分配系数,),较大,完全分离；, ,K,不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；,柱效较低，,K,较大,但分离的不好；, ,K,小，,柱效低，分离效果更差。,2.4.2,分离度方程,R,与柱效,n,、,选择因子,和保留因子,k,对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数,K,相差小，可合理假设,k,1,k,2,=k,，,W,1, W,2,=W,。,因此可导出,R,与,n,（,n,eff,）、,和,k,的关系,：,附：具体推导过程如下：,分离度、柱效和选择性参数的联系：,1,）分离度,R,与柱效,n,的关系,分离度与理论塔板数的平方根成正比，增加,n,或降低,H,，提高柱效即降低色谱峰区带宽度，从而提高分离度。根据板高方程，改变流速,u,降低固定相,d,p,、,d,f,或增加柱长来提高,n,。,对具一定相对保留值,的物质对，,R,与有效塔板数,n,eff,有关，说明,n,eff,可正确代表柱效能。,由色谱方程可得：,因此可通过增加柱长提高分离度。,2.4.3,有关色谱方程的讨论：,2,）分离度,R,与保留因子的关系,代表两个溶质在色谱条件下的分离选择性。,若 ,1,，两组分不可能分离；,略大于,l,，,就可能实现分离。,越大，柱选择性越好，对分离有利。,气相色谱主要通过选择合适的固定相和降低柱温来提高,值。,对于液相色谱，改变固定相和流动相性质，均能提高,值，通常采用改变流动相的组成和极性来提高,值。,k,增加，分离度,R,增加，但当,k10(,分离时间延长，并使色谱峰扩张）,，则,R,的增加不明显。通常,k,在,110,之间。,分离沸点或极性相差不大的多组分混合试样采用恒温或等度淋洗，难达到最佳,k,值，这种情况下，气相色谱采用程序升温、液相色谱采用梯度淋洗，调节合适的,k,值。,3,）分离度,R,与分配比,k,的关系,4),样品量的影响,每一个色谱柱固定相，都有一定的样品线性容量范围，在该范围内，进样量增加色谱峰高增加，色谱峰区域宽度和保留时间不变。当样品量超过线性容量范围，进样量增加，,k,下降。,对多组分混合物，分离时间即为最后一个组分的保留时间。,由以下三式：,得到,可见，分析时间与,R,，,k,、,H/u,等参数有关。,2.4.4,分析时间,t,概念、表示方法及计算公式汇总,表,-1,表,-2,习题,两物质,A,和,B,在,30cm,长的色谱柱上的保留时间分别为,16.4,和,17.63min,，,有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为,1.30 min,。,物质,A,和,B,的峰底宽分别为,1.11,和,1.21min,。,试计算：,1,）柱分辨率,R,；,2,）,柱平均理论塔板数,n,av,3,）,平均塔板高度,H,av,4,）,若要求,R,达到,1.5,，则柱长至少应为多少？,5,）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？,6,）不增加柱长，要求在原来的分析时间内,R,达到,1.5,，该柱的塔板高度应为多少？,1,）,2,）,3,）,4,）,解：,5,）,6,）,作业：,P60-P61,：,3,、,4,、,20,、,21,、,22,第,3,章 气相色谱分析,教学要求,1.,掌握气相色谱法的特点及适用范围。,2.,了解常用检测器原理、特点及适用范围。,3.,理解固定相及重要操作条件选择的原则。,4.,掌握常用定性方法和定量方法及其优缺点。,5.,了解气相色谱的应用和进展。,重点与难点,1.,气相色谱仪的检测器。,2.,气相色谱固定相。,3.,色谱定性和定量分析。,4.,气相色谱填充柱和开管柱的比较。,学时安排：,2,学时,