实验五、简单染色与革兰氏染色课件

福建农林大学生命科学学院,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五,简单染色与革兰氏染色,一 实验目的,1,、学习微生物涂片、染色的操作技术；,2,、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；,3,、初步掌握无菌操作技术；,4,、掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。,二 实验原理,简单染色,常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。,当细菌分解糖类产酸使培养基,pH,下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。,革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。,革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇,(,或丙酮,),脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫,-,碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇,(,或丙酮,),溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫,-,碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,二 实验原理,革兰氏染色,三 实验材料,培养,24,小时的大肠杆菌（,E.coli,），金黄色葡萄球菌,;,每个小组从土壤中分离得到的菌种；,载玻片,接种环,酒精灯及火柴,结晶紫染色液,碘液,95,乙醇,番红染色液,吸水纸,显微镜。,四 实验步骤,简单染色,制片染色水洗干燥镜检,（,1,）制片：,取菌种培养物,常规涂片,、自然干燥、加热固,定；,（,2,）染色：,将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复,红染色,1-2min,。,（,3,）水洗：,用水洗去涂片上的染色液。,（,4,）干燥：,将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸,干。,（,5,）镜检：,先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野,后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入,油滴中仔细调焦观察细菌的形态。,注意无菌操作,制片,初染,（结晶紫,1min,）,水洗,媒染,（碘液,1min,）,水洗,脱色,（乙醇,20-30s,）,水洗,复染,（番红,2min,）,水洗干燥观察,革兰氏染色,实验结果,实验完毕后的处理,将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：,a.,先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.,用擦镜纸沾少许,乙醚,-,乙醇混合,液将镜头擦,2-3,次。,c.,再用干净的擦镜纸将镜头擦,2-3,次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，按号放入显微镜柜中。, 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。,五 注意事项,1,、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。,2,、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。,3,、染色过程中勿使染色液干涸。,4,、选用幼龄的细菌。,5,、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞；,6,、滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡；,7,、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。,六 思考,1,、简单染色和革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？,2,、绘制简单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。,3,、简单染色和革兰氏染色的原理？,