竞争放射分析放射免疫分析课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,竞争放射分析,放射免疫分析,（,Radio,Immuno,Assay, RIA）,竞争性蛋白结合分析,（,Competitive Protein Binding Assay, CPBA）,放射受体分析,（,Radio Receptor Assay, RRA）,优点：,1、灵敏度高 3、应用范围广,2、特异性强 4、操作简单,缺点：,1、生物试剂，稳定性受多因素影响,2、灵敏度难以超过,ag,水平,竞争放射分析的原理,*,P,+,Q,=（,*P,Q,）+,*P,+,P = （P,Q,）+P,*P,：,标记物,P ：,未标记物,Q ：,特异性结合剂,放射免疫分析原理,*,Ag,+Ag+,Ab,= （,*Ag,Ab,）+（Ag,Ab,）+,*Ag,+ Ag,0 Max Min, ,条件：1、,*,Ag,定量、足量,2、,Ab,限量,*,Ag,Ab,专用符号：,1、,T,加入的,*,Ag,的放射性计数,2、,B,*Ag,Ab,免疫复合物的放射性计数,3、,B,0,Ag=0,时,*,Ag,Ab,放射性计数,4、,F,游离的,*,Ag,的,放射性计数,T=B+F,5、NSB,非,特异性结合产生的放射性计数,6、结合率：,B/T、B/B,0,、B/F,竞争放射分析的三种基本试剂,标准品,标记物,特异性结合剂,标 准 品,化学结构,：,应与被测物具有相同的化学结构,化学纯度,：,纯品,化学度量：,准确,稳定性：,保持生物活性不变,标 记 物,要求,：,1、较高的比活度,2、生物活性与免疫活性：与标记前一致,3、放射化学纯度：95%,4、稳定性,鉴定：,1、最大结合率,2、标准曲线比较法,3、稀释曲线比较法,特异性结合剂,要求：,1、亲和力 2、高滴度,3、特异性 4、可长期保存,抗 血 清,抗原,动物选择,佐剂,免疫动物、收获鉴定抗体,抗,血清的鉴定,亲和力,：,指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数,K,A,表示。,特异性：,抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用 交叉反应率（,Cross Reaction）,表示,交叉反应率=,Y/Z100%,Y：,标准抗原取代50%结合率所对应的浓度,Z：,类似物取代50%结合率所对应的浓度,交叉反应率测定：以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定，同时观察置换0标准管50时所对应的化学量,滴度：,结合50%标记抗原时血清的稀释度,单 克 隆 抗 体,特点：,特异性高,抗体成分专一,可反复制备,制备：,1、免疫小鼠，制备脾细,胞悬液,2、选择培养，用,HAT,培,养基筛选杂交瘤细胞,3、检测抗体,4、克隆化,其它特异性结合剂,血浆结合球蛋白,受体蛋白,放射性标记,T,4,与不同特异性结合剂,结合与游离部分的分离,分离方法的要求,1、使结合部分与游离部分尽可能完全,分开,2、分得的成分便于作放射性操作,3、分离效果不受外界干扰因素影响,4、操作简便、分离迅速、重复性好,5、试剂来源广泛、价廉易得,常用的分离方法,双,抗体法,聚乙二聚法（,PEG）,活性炭吸附法,盐析法,微孔滤膜法,SPA,法,固相抗体法：,塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球,磁化颗粒法,屏蔽计数法,竞争放射分析方法的建立,反 应 方 式,平衡法,顺序加样法,STAT,法,试 剂 用 量,高,含量样品,：,灵敏度高，,B,0,/T,在3050%,低含量样品,：,高剂量斜率好，,B,0,/T,在5070%,反 应 介 质,pH,和离子强度,反应体积,添加剂,样品处理,加 样 程 序,实验设计、,配制试剂,加未标记物（标准品或待测样品）,加标记物,加特异性结合剂,混匀、温育,加分离剂、分离,B,与,F,测量各管放射性计数，绘制标准曲线,由标准曲线反求出样品浓度,免 疫 放 射 分 析,（,Immunoradiometric,Assay,IRMA）,IRMA,的基本原理,单位点系统：,Ag + *,Ab, (Ag-*,Ab,) + *,Ab,ImAd,-Ag + *,Ab,ImAd,-Ag-*,Ab,IRMA,与,RIA,的主要区别,IRMA,的实验方法,单位点系统,双位点系统,标记第三抗体法,双标记抗体法,IRMA,的特点,标记物的放射性活度高,反应达到平衡快,比,RIA,更高的灵敏度,比,RIA,的标准曲线范围更宽,比,RIA,的特异性更高,方法稳定性好,目前仅能检测大抗原,数 据 处 理,作图法,数学模型计算法,几种数学模型,线性内插,多项式函数,样条函数,直线化模型,Logistic,模型,四参数,标准曲线应符合的条件,B,1,/B,0,85%，,B,n,/B,0,3,标准曲线的质控参数,B,0,%：3070% ，50%,最佳,NSB/T5%，NSB/B,0,0.99,质 量 控 制,近期目的：,通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍,远期目的：,通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量,误差及引起误差的原因,试剂,加样误差,分离误差,测量误差,数据处理,样品的采集与制备,质量控制指标,精 密 度,用,同一实验方法多次检测同一样品所得结果的一致程度和重复性,标准差、变异系数、效应误差关系、精密度图,准 确 度,测定值与真值的符合程度,用回收试验及平行实验来评价,灵 敏 度,测定方法的最小可测量,确定方法：,零标准管法、,t,值检验法、,粗略估计法,特 异 性,特异性决定于抗体,常用交叉反应率表示,稳 定 性,指批间的,重复性,常用指标：,B0%、NSB、ED、r,等,临床有效性,与临床的符合程度,真阳性率、真阴性率、假阳性率、真阴性率,内 部 质 控,批内质控：,批间质控：,外 部 质 控,目的：,提高各实验室之间检测结果的可比性,方法：,由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。,体外,放射分析的误差,室内质控,室间质控,批内质控,批间质控,批内,精密度与偏听偏信倚分析,批间,精密度与偏听偏信倚分析,寻找误差产生的原因、改进分析工作质量,对某种,分析方法、试剂或试剂盒进行综合评价,对,不同实验室的分析工作质量进行比较,向,主管部门提供信息，对方法、试剂（盒）进行改进，促进实验室内部的质量控制工作,非,放射性标记免疫分析技术,酶,标记免疫分析法,化学发光法,时间分辨免疫荧光分析法,基因芯片技术,