DNA提取与保存

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,不可忽视的细节,血液基因组提取,1,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,2,没有严格要求,:,PCR,Southern Blots,RFLP,严格要求片段长度,:,构建文库,PFGE(脉冲场凝胶电泳),DNA Length,DNA提取原则1：DNA片段长度,3,没有严格要求,常规,PC,R,严格要求产物纯度,存档、产物长期保存,Southern杂交,荧光定量PCR,SNP Microarray,CGH (比较基因组杂交),DNA提取原则2：DNA产物纯度,4,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,5,基因组提取方法,溶液盐析法：,无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高,硅胶膜吸附法：,利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸,磁珠法：,独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。,传统酚氯仿法：,传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。,6,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,7,样本保存和前处理,抗凝血液,保存,柠檬酸、,EDTA,、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或,EDTA,处理血样。加入抗凝剂混匀后,2-8,保存一周；,20,保存一个月；,70,长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。,样本前处理,1.,冻存的抗凝血液使用前溶解应在,37,水浴迅速溶解。,2.,抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。,8,样本保存和前处理,非抗凝血,保存,非抗凝血即血凝块。,-20,保存一个月；,-70,长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。,样本前处理,1.,冻存的血凝块使用前应在,37,水浴溶解，轻柔颠倒混匀。,2.,血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。,血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！,9,样本保存和前处理,白膜层,保存,全血分离得到的白膜层放置,-20,或,-70,长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。,样本前处理,1.,白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到的沉淀。,2.,冻存的白膜层使用前应在,37,水浴溶解，轻柔颠倒混匀。,3.,虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。,4.,采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：,1ml,全血得到的白膜层提取时需要加入提取,1ml,全血的试剂量。,10,样本保存和前处理,血清/血浆,保存,现在很多科研者使用血清,/,血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清,/,血浆放置,-70,保存。尽量避免样本反复冻融。,样本前处理,1.,冻存的血清,/,血浆使用前溶解应在,37,水浴溶解，轻柔颠倒混匀。,2.,血清,/,血浆核酸提取时无需红细胞裂解。,3.,只需,100-200ul,样本，基本能满足下游常规,PCR,或荧光定量,PCR,检测。,11,样本保存和前处理,微量血液/干血点/羊水/胸水,保存,微量血液：抗凝血液,-20,或,-70,保存；干血点：干燥后室温或,4,保存；羊水：,-20,或,-70,保存。,样本前处理,1.,微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。,2.,干血点加入缓冲液直接进行提取。,3.,羊水,/,胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。,12,样本保存和前处理,口拭子/漱口水,保存,口拭子：干燥后室温保存漱口水：,4,保存或离心得到沉淀,-20,或,-70,保存,样本前处理,1.,拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。,2.,有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。,3.,漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。,13,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,14,基因组提取流程,加入吸附柱,缓冲液漂洗,DNA洗脱收集,样本裂解,纯化去蛋白,沉淀核酸,洗涤去盐,溶解DNA沉淀,样本裂解,溶液法（盐析法）,吸附柱法,15,红细胞裂解,哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：,采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照,3,倍全血体积加入进行裂解,).,采用细胞裂解液进行裂解（,TIANGEN,的细胞裂解液,CL,是按照,2.5,倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组,DNA,的提取。,红细胞裂解充分的现象：得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。,16,核细胞裂解,如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。,加入裂解液（如：,TIANGEN,试剂盒中的,GB,或,FG,）和蛋白酶,K,需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。,水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间,10-30min.,若采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。,17,核酸吸附或沉淀,硅胶膜吸附法,1.,加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。,2.,将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低,pH,值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。,溶液法,1.,当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。,2.,加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外力而降解。,3.,分离沉淀的方法：,a.,用枪头小心地将丝状沉淀挑出；,b.,离心分离，应保证一定的转速和时间。,18,核酸洗脱或溶解,硅胶膜吸附法,1.,用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液,TB buffer,（或自己配制的,buffer,）后放置,5-10 min,后再进行离心得到基因组,DNA,。,溶液法,1.,使用,70-75,乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解,DNA,前需要室温或,37,放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的,TB buffer,（或自己配制的,buffer,）溶解,DNA,。,19,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,20,浓度：,100,300ng/ul,纯度：任何杂质都可能导致,DNA,在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。,温度：纯化得到基因组,DNA,之后需将,DNA,溶液分装保存到,-20,，反复冻溶会导致,DNA,的降解。,溶解,DNA Buffer,：纯化得到的基因组,DNA,最好溶解在,TB Buffer (TIANGEN),或者,Tris,缓冲液里，因为大片段的基因组,DNA,在酸性水溶液中不稳定，易水解。,核酸保存,21,纯度（,OD260-320 /OD280-320,）,紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保,OD260,值在,0.11.0,之间，通常离心柱法稀释,4,5,倍；溶液裂解法稀释,20,30,倍）,OD260-320 /OD280-320 1.9,说明有部分降解或有,RNA,污染,得率,紫外分光光度计进行测量,Yield,OD26050ng/ul,稀释倍数,DNA检测方法,紫外分光光度法,22,Tiangen 产品提取得率,产品详细细节请直接点击产品名称,样本,处理量,DNA/RNA,得率（,g,）,推荐试剂盒,哺乳动物全血,100l,2,DP327-,磁珠法基因组提取试剂盒,DP316,-,微量样品基因组DNA提取试剂盒,200l,4-12,DP318-,血液基因组提取试剂盒,(0.1-1ml),600l,12-20,1ml,4-30,DP319-,血液基因组提取试剂盒,(0.1-20ml),5ml,100-200,20ml,300-700,禽类、两栖类全血,5-20,5-40,DP318-,血液基因组提取试剂盒,(0.1-1ml),血凝块,200-500ul,1-8,DP318/ DP319,500-1000ul,8-15,DP318/ DP319,1ml-5ml,5-150,DP319,口腔拭子,1,个,0.5-3.5,DP322-,口腔拭子基因组提取试剂盒,23,DNA检测方法,电泳检测,取2,l 洗脱液,1% 琼脂糖凝胶电泳, 检测DNA分子大小，纯度以及完整性,TIANamp 血液基因组DNA提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的DNA电泳图,电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。,如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。,若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组,DNA,有降解。,24,TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取,1,l，10l，50l，100l为起始样本提取基因组,。各取2l基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。,DNA检测方法,荧光定量PCR检测,微量样本基因组DNA的检测通常采用荧光定量PCR检测，例如：干血点、微量血液等。,25,DNA,提取的原则,基因组提取方法,样本保存和前处理,基因组提取流程,DNA,保存及检测方法,试剂选择原则,内容,26,试剂选择指南,硅胶膜吸附法,微量样本（DP316）,口拭子（DP322）,0.2-1ml血液(DP318),应用：,1.,HLA分型、亲子鉴定及芯片检测实验：对DNA的纯度、浓度均有要求。2. 口拭子等特殊样本的提取,适合样本：,全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞、口拭子、干血点、羊水、血清/血浆、漱口水、微量组织等,溶液法(DP319),应用：,下游实验所需DNA量较大，例如SNP,适合样本：,全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞等,磁珠法(DP327),应用：,微量样本DNA提取，可配合工作站使用。,适合样本：,微量血液、干血点、微量组织,27,