肿瘤的基因治疗课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,肿瘤的基因治疗,现已证明，,肿瘤,的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变导致细胞增殖分化和凋亡失调的结果。针对,肿瘤,发生的遗传学背景，将外源性目的基因引入,肿瘤,细胞或其他体细胞内以纠正过度活化或补偿缺陷的基因，从而达到,治疗肿瘤,的目的，即为,肿瘤,的基因治疗。,目前，,肿瘤,基因治疗的主要途径包括：抑癌基因治疗，癌基因治疗，免疫基因治疗，药物敏感基因（自杀基因）,治疗,，多药耐药基因治疗，,肿瘤,血管基因治疗等。,一.针对抑癌基因的基因治疗,研究,表明，几乎一半的人类,肿瘤,均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与,肿瘤,的生长有着密切的关系。因此，将正常的抑癌基因导入,肿瘤,细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制,肿瘤,的生长或逆转其表型的抑癌基因治疗策略，必将成为,肿瘤,基因治疗中的一种重要的,治疗,模式。,二.针对癌基因的,治疗,癌基因是指细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。因此，这种基因在人的正常细胞中就已存在。在绝大部分情况下，这类潜在的癌基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用。但是当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。如,Ras、Myc、Src,等基因，由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传导途径，促使细胞异常生长。因此将癌基因反义序列导入癌细胞使之封闭，是抑制肿瘤的另一种方式。,Wei,等用反义,Myc(,片段构建)重组腺病毒载体,Ad-As-Myc，,发现能显著抑制肺腺癌,GLC-82,和,SPC-A-1,细胞生长和克隆形成，并诱导其凋亡。,RT-PCR,和,Western,印迹显示,MYC,基因表达下降，凋亡相关基因,Bcl-2,和,Bax,分别出现下调和上调。瘤内注射,Ad-As-Myc,可抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长(抑瘤率为52)。对肝癌细胞,BEL-7402、HCC-9204、QSG-7701,和,SMMC-7721、,胃癌细胞,MGC-803、SGC-823,均有抑制作用，表明反义,Myc,具有广谱的抗肿瘤作用。,三.免疫基因治疗,1. 针对免疫应答细胞：常用的免疫细胞有两种：免疫效应细胞和树突状细胞。,2. 针对,肿瘤,细胞的免疫基因治疗,免疫效应细胞介导的基因治疗,将细胞因子导入抗,肿瘤,效应细胞中以增强抗,肿瘤,作用，并以免疫效应细胞为载体将细胞因子基因携带至体内靶细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活,肿瘤,局部及周围的抗,肿瘤,免疫功能。常用的免疫效应细胞有TIL、LAK、M、NK等，可供选择的目的基因有白介素、干扰素、,肿瘤,坏死因子、集落,刺激,因子、趋化因子等。在这些目的基因中，早期尤以IL-2的,研究,最多。Tam等根据NK细胞的杀伤活性及扩增能力等依赖于IL-2的特点，将IL-2基因转染至一株对多种,肿瘤,细胞具有杀伤作用的人NK细胞株NK-92(依赖外源IL-2)，构建了不再依赖外源IL-2的新型NK细胞株NK-92MI(高表达IL-2)及 NK-92CI(低表达IL-2)，发现NK-92MI及NK-92CI对,肿瘤,细胞株(K562、Raji等)的杀伤活性与NK-92相比无显著差异，也不影响正常的造血前体细胞的功能。,此外，还有,Nishihara,等用反转录病毒载体将,IFN-,g,、,IL-4,、,IL-6,或,TNF-,a,等基因分别转染至小鼠细胞株,J774A.1,，发现该细胞对,肿瘤,细胞的杀伤活性明显增强。,Mizuno,等则将,IFN-,g,基因转染至,LAK,细胞增强其杀,肿瘤,活性。,树突状细胞介导的基因治疗,DC,细胞是人体最有效的,APC,，能致敏和激活静止,T,细胞和,B,细胞。,T,细胞直接或通过分泌细胞因子，,B,细胞通过分泌抗体，作用于靶细胞或病原体上，最终消灭靶细胞或病原体。最近几年，,DC,细胞作为,肿瘤,生物,治疗,和基因治疗的方案已获,FDA,批准并进入,III,期临床。该疗法比传统的,LAK,细胞疗法和,CIK,细胞疗法具有更特异及更强大的杀瘤活性，被誉为当前,肿瘤,生物,治疗,和基因治疗最有效的手段。,比较成熟的制备,DC,细胞的方法是采用抗原基因、抗原和细胞因子来转染和修饰,DC,细胞。常用的有：抗原肽,刺激,和各种抗原基因，如大肠癌,-APC,、,CL3,；宫颈癌,-E7,、,E6;,前列腺癌,-FTI-1,、,PSA,等；,肿瘤,提取物；细胞因子。动物实验结果表明，转导,肿瘤,特异性抗原基因的,DC,细胞可使,肿瘤,组织减小。,Wang,等用小鼠肝癌总,RNA,转染的树突状细胞体外诱导特异性细胞毒,T,淋巴细胞的,研究,发现，转染的,DC,其组织相容性,分子,(MHC-I,、,II),及共,刺激分子,(B7-1,、,B7-2),表达明显增高，,刺激,同基因型小鼠,T,细胞可使增殖能力增强，且还能诱导,Hepa1-6,肝癌细胞特异性的,CTL,产生。,Fan,等构建的,AFP-DC,（,AFP,，,Alpha fetoprorein,甲胎蛋白，在原发性肝癌中呈高表达）瘤苗不仅能产生和分泌,AFP,，而且还能上调自身的,B7,分子,和,MHC,分子,，明显,刺激,T,细胞增殖及提高,CTL,的杀伤作用。,DC,细胞增强抗,肿瘤,免疫反应的另一机制是编码,CD40,配体的基因转录。,CD40,配体的表达可通过,DC,已表达的,CD40,之间的相互作用自动激活，这可直接,刺激,抗原特异性的,CD8,T,细胞而无需,CD4,T,细胞的介导。事实上，在小鼠黑色素瘤中，这种机制可引起,肿瘤,退化，生存期限延长。,Kikuchi,等,研究,发现，同时向,肿瘤,内注射表达有,CD40,的腺病毒载体和改造过的,DC,，可引发,肿瘤,特异性的免疫反应，抑制,肿瘤,生长，并增加,肿瘤,CD40,配体的表达。因此，,肿瘤,细胞转基因,CD40,配体的表达可明显增强,DC,表达,CD40,，从而增强其抗,肿瘤,活性,针对,肿瘤,细胞的免疫基因治疗,增加,肿瘤,细胞表达细胞因子,Shiau,等用含,IFN-,的逆转录病毒进行膀胱癌切除后的免疫基因治疗，即增加,肿瘤,细胞在局部产生,IFN-,，以诱导淋巴细胞的反应而达到,治疗,目的。,Hull,等用伴有,IL-12/B7,（,AdmIL-12,）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的,RM-9,鼠前列腺癌模型，发现在感染的,RM-9,鼠,肿瘤,细胞中,AdmIL12/B7,能介导,IL-12,分泌和增加,B7-1,在细胞表面的表达，明显减少,肿瘤,体积和增加鼠的存活率。,Lv,等用腺病毒介导的,IL-2,基因及,B7-1,基因联合转染,G422,胶质母细胞瘤，结果发现,肿瘤,生长明显减慢，脑内接种的动物存活期明显延长，,NK,、,LAK,和,CTL,的杀伤活性增强，说明,IL-2,基因转移确实能使,肿瘤,细胞的致瘤原性下降。,除了,IL-2,外，还有很多对其它细胞因子的,研究,，如,IL-1,、,12,、,18,、,23,等。,免疫相关基因导入肿瘤细胞,肿瘤,抗原需与,MHC-I,类分子结合，被,CD8+CTL,识别，被,APC,摄取加工后与,MHC-II,类分子结合，再被,CD4+Th,识别，方可激活肿瘤免疫。而,MHC-I,和,MHC-II,途径都需,B7,共刺激。肿瘤细胞低表达或不表达,MHC-I,或,MHC-II,及共刺激分子，是其抗原呈递发生障碍，最终逃脱机体免疫的重要原因。,Chen,等将人类乳头状瘤病毒,(HPV-16),的,E7,基因转染黑色素瘤细胞株,K1735,，以期通过,E7,基因的表达来增强肿瘤细胞的免疫原性，再将,B7,基因转染该细胞株以增强肿瘤细胞所缺乏的共刺激信号，发现单纯转染了,E7,基因的肿瘤细胞在体内,100,成瘤，而同时转染了,E7,和,B7,基因的肿瘤细胞在体内完全丧失了致瘤能力。进一步研究证明，通过,B7-1,基因转染的结肠癌在小鼠体内诱导产生了特异性杀伤细胞,CTL,。,Kikuchi,等将共刺激分子,CD40,基因的重组腺病毒直接注入小鼠黑色素瘤、结肠癌及,Lewis,肺癌等实体瘤内，发现,60,以上的小鼠黑色素瘤及结肠癌得以治愈，而免疫原性极弱的,Lewis,肺癌也有部分治愈。对,MHC,基因转染后肿瘤细胞致瘤性的研究也有类似的报道。,四、自杀基因治疗或酶药物前提疗法,自杀基因,(Suicide gene),，就是可引起细胞死亡的基因；亦即将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入,肿瘤,细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在,肿瘤,细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死,肿瘤,细胞的目的，也称药物敏感基因,(Drug sensitive gene),。,常用的自杀基因包括：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,(Herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-tk),、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因,(Varicella-zoster virus-thymidine, VZV-tk),、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因,(E. coli-cytosine deaminase, CD),、细胞色素,P-450,基因、大肠杆菌黄嘌呤,-,鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因,(Glunaine phosphoribosyl transfeRase, GPT),等。,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（,HSK-tk,）基因是最有特点的自杀基因，它编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物,(NA),代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗,肿瘤,作用。病毒源性的,tk,基因可催化抗病毒核苷类似物,acyclovir(ACV), ganciclovir(GCV), bromovinydeoxyuridine(BDVdU),这些前药不能在细胞,TK,的作用下磷酸化，因而其本身对细胞无毒或毒性很低。但,HSV-tk,基因导入细胞并表达后，生成特定的酶，这些酶将这些前药三磷酸化，转换成毒性产物，阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡。,Hall,等的实验,研究,发现，把腺病毒介导的,HSV-TK/GCV,注射到有前列腺癌的小鼠体内，可明显抑制前列腺癌的生长，并能使癌的肺转移率降低约,40,。,Shalev,等对,治疗,失败或发生转移的前列腺癌患者用此方法进行,治疗,，也取得了较好的临床效果。,五、耐药基因治疗,多药耐药,(Mulitiple Drug Resistance,，,MDR),是指,肿瘤,细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。,MDR,是影响,肿瘤,化疗疗效的重要因素之一。因此，如何消除,MDR,的影响，提高化疗药的药效就成了人们,研究,的热点。而耐药基因治疗就是针对此产生的，即将一些细胞毒药物的基因转移至造血干细胞,以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀死,肿瘤,细胞而不破坏骨髓细胞。,常用的耐药基因包括：,MDR-1(Multidrug resistance 1)gene,等。,人类基因组中含有两个,MDR,基因，即,MDR1,和,MDR2,，二者有高度的同源性，但是,MDR2,不参与,MDR,的产生过程。,MDR1,基因组编码,1280,个氨基酸多肽,(P-glycoprotein, P-gp,，,p,糖蛋白,),。现已证明，,P-gp,与耐药相关蛋白,(Multidrug resistance-associated protein , MRP),密切相关。,P-gp,与,ATP,结合，利用,ATP,水解产生的能量进行跨膜转运，对疏水性抗,肿瘤,药,(,如,actinomycin D,等,),有较强的外排作用。当,P-gp,与抗,肿瘤,药物结合后，通过,ATP,提供的能量，将药物从细胞内泵出细胞外，导致细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，最终出现耐药现象。,Wang,等利用逆转录病毒载体高效介导抗,MDR1,核酶的基因进入有,MDR1,基因表达的,肿瘤,细胞中，发现转导的,肿瘤,细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性，阻断了,MDR1 mRNA,和,P-gp,的表达。临床上应用,MDR1,基因转移主要集中在骨髓干细胞。,六、抗血管生成基因治疗,肿瘤,的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质。因此，早在,1971,年，,Folkman,等就提出可通过阻断,肿瘤,血管的生成来抑制,肿瘤,的生长，防止,肿瘤,的转移。因为在,肿瘤,的转移过程中，,肿瘤,血管的生成是必需的。这就使人们对与新血管生成和,肿瘤,血管成熟有关的前血管生成因子进行了大量的,研究,。,VEGF,是,肿瘤,诱导血管生成过程中一个主要的调节因子，它可选择性,刺激,内皮细胞分裂，并能增加微血管的通透性。通过阻断,VEGF,的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。一种,治疗,方法就是引入一段反义,VEGF,的,cDNA,基因，通过与,VEGF,的,mRNA,结合，来抑制,VEGF,蛋白的翻译。,七、问题与展望,基因治疗作为一种崭新的,治疗,手段，为攻克癌症带来了希望，从理论上说应该效果是很理想，但在实际应用中，还有很多问题有待解决。如（,1,）外源基因的表达效率问题。（,2,）外源基因表达调控问题。（,3,）在处理多系统基因紊乱过程中基因治疗的作用远未阐明；（,4,）基因治疗另一个潜在的风险是反转录病毒载体是随机地将外源基因插入宿主基因组，如果插入不当可能会破坏另一个基因表达或激活其它基因；另外在实验操作时有可能将辅助病毒污染重组病毒，造成病毒在宿主体内大量扩增。虽然基因治疗在临床上对部分,肿瘤,显示出较好的抗癌、抑癌作用，但是所使用的均是寿命较短的细胞，病人需要重复输入外源基因的细胞，致使医疗费用过高，难以普及，且其长期疗效和不良作用尚不清楚。因此，选择适宜的靶细胞以使基因治疗效果得以长期维持，一劳永逸地解决,肿瘤治疗,问题是基因治疗的发展方向。,在后基因组时代各种,肿瘤,基因治疗都有各自的策略。目前基因治疗重点有以下几个方面：（,1,）联合基因治疗（,2,）增强,肿瘤,的免疫反应（,3,）修复细胞周期中因,肿瘤,抑制基因丧失或癌基因激活而造成的细胞,DNA,损伤（,4,）自杀基因治疗，基因标记,研究,与在基因治疗中对正常组织的保护措施等。在这些热点,研究,中，联合基因治疗及自杀基因与其它疗法联合应用为重中之重，因为这不但符合,肿瘤,发生发展的规律，而且也弥补了单基因、单一疗法应用的不足。因此认识到,肿瘤,发生的复杂性及机体在此过程中千变万化的状态，选择适合的,治疗,方式，从多方面入手，达到几种,治疗,方式的相辅相成，或建立,治疗,的个体化方案，才能使目前的基因治疗具有突破性的发展，基因治疗才能真正用于临床，造福于,肿瘤,患者。,