第六章DNA重组与克隆课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因重组与基因工程,Genetic Recombination and,Gene,cloning,第六章,DNA,分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。,重组产物称为重组体。,基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样）,重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。,DNA,重组,接合作用,(conjugation),转化作用,(transformation),转导作用,(transduction),#,转 座,(transposition),#,同源重组,(homologous recombination),#,位点特异的重组,(site-specific recombination),异常重组,发生在同源序列间的重组称为同源重组,(homologous recombination),，又称基本重组。是最基本的,DNA,重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个,DNA,分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以,E.coli,的同源重组为例，了解同源重组机制的,Holliday,模型。,6.1,、同源重组,Holliday,模型中，同源重组主要,4,个关键步骤,两个同源染色体,DNA,排列整齐,一个,DNA,的一条链断裂、并与另一个,DNA,对应的链连接，形成,Holliday,中间体,通过分支移动产生异源双链,DNA,（立体异构）,Holliday,中间体切开并修复，形成两个双链重组体,DNA,，分别为：,片段重组体,(patch recombinant),拼接重组体,(splice recombinant),片段重组体,：,切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其,两侧,来自同一亲本,DNA,。,拼接重组体,：,切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的,两侧,来自不同亲本,DNA,。,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,内切酶,(recBCD),DNA,侵扰,(recA),分支迁移,(recA),内切酶,(recBCD),DNA,连接酶,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,3,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,Holiday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,目 录,片段重组体,（见模型图左边产物）：,切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本,DNA,。,拼接重组体,（见模型图右边产物）：,切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本,DNA,。,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,Holiday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,5,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,内切酶,(ruvC),内切酶,(ruvC),DNA,连接酶,DNA,连接酶,片段重组体,拼接重组体,目 录,分支移动的过程伴随着,DNA,的修复,同源重组是减数分裂的原因。,同源重组是由于碱基间的精确配对实现的,异源双链与基因交换,同源重组时会产生异源双链，从而发生基因交换。,减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换）,基因转换频率在非对称异源双链区较高。,基因转换也可以在有丝分裂时姐妹染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生,Holliday,模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。,在,Holliday,基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间,DNA,的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子,P138-139,）,细菌的基因转移与重组,低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细胞间的基因转移。,具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。,外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。,一、接合作用（,conjugation),当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接,触时，质粒,DNA,从一个细胞（细菌）转移至,另一细胞（细菌）的,DNA,转移称为接合作用。,F,因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、,DNA,转移通道蛋白等、,F,因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体,二、转化作用（,transformation,),通过自动获取或人为地供给外源,DNA,，,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,感受态细胞,高浓度钙可以诱导感受态,例：,溶菌时，裂解的,DNA,片段被另一细菌摄取。,三、,转导作用（,transduction),当病毒从被感染的细胞（供体）,释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间,的,DNA,转移及基因重组。,溶 菌,感 染,重 组,感 染,细 菌,噬菌体,图,15-3,转导作用,转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞,之间的,DNA,转移及基因重组,转导,：,当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的,DNA,转移及基因重组即为转导作用,转导,(transduction),*,转染,(transfection),转染是转化的一种特殊形式。,由,transformation,（转化）和,infection,（感染）两词构成。,原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。,通过,感染方式,将外来,DNA,引入宿主细胞，并导致宿主细胞,遗传性状改变,的过程称为转染。,将任何类型,DNA,转移至动物细胞内的过程均可叫转染。,细菌的细胞融合,由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。,（原生质体融合）,细菌的同源重组的酶学机制,1,、,RecBCD,（外切核酸酶,）和,Chi,位点,具有解旋酶（再旋）活性、,ATPase,活性、核酸外切酶活性、,序列特异性的单链内切酶活性,单链内切酶活性和解旋酶活性使,DNA,产生具有游离末端的单链,RecA,的作用位点,RecBCD,有固定切割位点,原核生物的重组酶学机制已经比较清楚,Chi,位点出现几率很高，是,RecBCD,的靶位点,GCTGGTGG,3,RecBCD,的识别和切割位点,a,、,RecBCD,结合在,DNA,的平,头末端（产生机制不清楚）,b,、,外切、,解链、移动,（,ATP,）,c,、,兔耳状,loop,结构产生,再旋酶活性低于解旋酶活性）,d,、,RecBCD,在,loop,单链区的,chi,位点,3,方,4,6NT,处切,断单链（单链内切酶）,chi,位点：,GCTGGTGG,目前发现的重组热点,E.coli,含,1000,个、,Euk.,e,、,RecBCD,切割产生,3,单链末端,2,、,RecA,蛋白,（,1,）,活性,a,、,RecA,有单、,双链,DNA,结合活性,b,、,RecA,有,NTPase,活性（底物差异活性）,与单链,DNA,结合时活性最大,-,依赖于,DNA,c,、,RecA,有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子,的能力，即联会同源,DNA,（但其靶,DNA,必须有缺口结合,DNA,）,RecA,入侵单链,被置换连,RecA,引发链侵入模型,RecA,引起的链交换和,Holliday,结构的生成,（,2,）,RecA,蛋白催化双链和单链,DNA,的反应阶段,a,、,联会前阶段（缓慢）,RecA,与单链结合,b,、,单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子,Holliday,（,5,侵入）,c,、,从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链,DNA,反应结束时，,RecA,结合到双链上,其中,单链同化有固定的方向,入侵单链进入的方向是,5,3,，,双链,DNA,的互补链是,3,5,RecBCD,和,RecA,的共同作用,RecBCD,产生游离单链,-,RECA,因子接到重组反应,3,、原核同源重组的其它蛋白,需要,E.coli,中三个基因,ruvA,ruvB,和,ruvC,的产物,a,、,RuvA,识别,Holliday,结构的连接点,b,、,RuvB,为分枝迁移提供动力（,ATPase 10,20bp/s,）,c,、,RuvC,核酸内切酶,-,专一性识别,Holliday,结构的连接点,体外切段连接点以拆分重组体,E.coli,重组的各阶段,（损伤修复）,损伤,DNA,复制产生缺口,RecA,链交换,第二次链交换,DNApol,通过,DNA,合成填满缺口,RuvA,B,分枝迁移,RuvC,切割,Holliday,连接点,真核生物同源重组机制自学,7.2,、位点专一性重组（,site-specific recombination,）,1,、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的,DNA,分子间,的重组（,包括一些基因表达调节、发育过程中,DNA,重排）,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,2,、特征：,在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接,-,产生精确的,DNA,重排,都具有整合作用的两个基本特征,a,、,典型的保守性重组,-,交换是相互的和保存原先的,DNA,b,、,发生在噬菌体和细菌,DNA,短同源序列的专一性核苷酸上,二、,phage,的整合与切除（溶原和裂解状态）,1,、实现机制：,均是通过,-,细菌,DNA,和,DNA,上特定位点之间的重组,2,、特定位点,-,附着位点（,attachment site,att,）,E.coli attB,含,BOB,三序列,23bp,phage,attP,含,POP,三序列,240bp,核心序列 “,O,”,完全一致,（同源部分）,-,位点特异性重组发生的地方,B,B,P,P,-,臂,3,、整合过程,整合后的附着位点为,attL,（,BOP,）,attR,（,POB,）,整合位点,-attB,、,attP,切除位点,-attL,、,attR,整合过程需要,整合酶,（,integrase Int,）（,编码,）,和,寄主的整合宿主因子,IHF,（,integration host factor,）,共同作用,溶源性细菌,(lysogen),溶菌周期,（,lysis,）,原噬菌体,4,、整合分子机制,核心序列,O,全长,15bp,，富含,A-T,发生在,O,内的重组交换位点相距,7bp,整合酶的结合位点：,attP 240bp,、,attB 23bp(,两者的作用不同,),attP,位点的负超螺旋为重组所必须,-,加强了,Int,和,IHF,的亲和力,-,高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构,Int,结合,-,核心序列的反向位点（切割位置）,-,结合在,att,臂上（臂与核心区靠近）,int,IHF,Xis,整合体及其作用,整合体（,intasome,）,-,Int,和,IHF,结合到,attP,时的复合物,整合体捕获,attB,说明,-,a,、,attB,和,attP,的,最初识别靠,Int,识别两序列的能力,b,、,两序列的同源性,在链交换时为,重要因素,Int,蛋白能,切断,DNA,，并使它重新,连接,，近而使,holliday,结构,拆分,重组时,attP,和,attB,部位交叉断裂，,互补单链末端,进行交叉杂交,例（二）细菌的特异位点重组,沙门氏菌,H,片段倒位决定鞭毛相转变,hix,为反向重复序列，它们之间的,H,片段可在,Hin,控制下进行特异位点重组,(,倒位,),。,H,片段上有两个启动子,P,，其一驱动,hin,基因表达，另一正向时驱动,H2,和,rH1,基因表达，反向,(,倒位,),时,H2,和,rH1,不表达。,rH1,为,H1,的阻遏蛋白基因。,H2,鞭毛素,阻遏蛋白,Hin,重组酶,转位片段,hin,H2,I,H1,H1,鞭毛素,hin,H2,I,DNA,启动序列,H1,启动序列,沙门氏菌,H,片段倒位决定鞭毛相转变,P197,7.3,、转座成分概述,1,、,转座子,(,元,),或转座元件,(transposon or transposable element):,基因组上不必借助于同源序列就可以移动的,DNA,片段，它们可以直,接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）,转座（,transposition,）,：转座元的转移过程（不十分确切）,2,、发现和发展,1914 A. Emerson,1936,Marcus . M. Rhoabes,玉米果皮、糊粉层花斑突变,玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理,跳跃基因（,jumping gene,）,1947,冷泉港实验室（美）,Barbara McClintock,a),不依赖,供体序列,与靶位点间序列的同源性,b),转座不是简单的转移，涉及转座子的复制,Hotspots,(,热点,),Regional preference,(,在,3kb,区域内的随机插入,),d),某些转座因子（,Tn3,）对同类转座因子的插入具有排他性,（免疫性）,e),靶序列在转座因子两侧会形成正向重复,f),转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应,3,、转座重组的特点,c),转座插入的靶位点并非完全随机,（插入专一型）,二、,Prok.,转座子种类,两种类型： 简单转座子（,simple transposon,）,（插入序列,insertion sequence IS,）,复合转座子（,composite transposon,）,共同特征：,a,）两端有,20,40bp,的,IR(,反向重复序列,),b,）具有编码转座酶（,transposase,）的基因,1,、插入序列（最简单的转座子称作插入序列）,最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分,命名：,IS,编号（鉴定类型）,长度,700,2000bp,特点：,a,）两端,IR,为转座酶的识别位点（突变）,b,）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（,3,9bp,）,IS,可以正反方向插入到,DNA,（宿主、质粒或某些噬菌体），,常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应,a),Tn / TnA family,l,具有,IR,、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因,l,Tn1 (Amp,R,) Tn2 (Amp,R,),Tn3 (Amp,R,) Tn4 (Amp,R,Str,R,),Tn5 (Kan,R,) Tn6 (kan,R,),Tn7 (Str,R,Tmp,R,) Tn9 (Cam,R,),Tn10 (Tet,R,),2.5 kb 20 kb,Tn3 IR TnpA Res TnpR Amp,R,IR,38bp 38bp,转座酶,regulator -,内酰胺酶,2,、复合转座子,两种类型,b,）,两端重复序列为,IS,的复合转座子,e.g.,IS,插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子,IS,IS,IS,IS,L,IS R,臂 中心区 臂,transposition,当两个,IS,组件相同时，其中任一个都可行使转座功能,不同时，主要依靠一个,两侧的,IS,既可以是,IR,，又可以是,DR,状态,（,IR,多）,3,转座噬菌体,Mu phage,（巨型转座子 ）,C,repressor for A, B,B,33 kd,与转座有关,A,70 kd,转座酶,U, S,毒性蛋白,attL, attR,与寄主同源，反向重复，转座必需,Gin,G,区倒位酶,att L C A B S U att R,150bp 1.5kb,G,倒位区,38kb,P,gin,以,E.coli,为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）,Mu,的插入途径,a,）,侵入的,Mu,在溶源化过程中任意插入寄主,DNA,（两侧各,5bp,的靶位点序列重复）,b,）,进入,裂解生长后，复制产生后代,Mu DNA,几乎全部插入寄主,DNA,中，并可继续转座（形成寄主,DNA,和,Mu,的共合体），噬,菌体成熟时，切段共合体包装,三、转座子的转作机制及模式,三种类型：复制型、非复制型和保守型,1,、复制型转座模式,实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程,扩增了转座子的拷贝（供、受点）,需两种酶： 转作酶（作用于原拷贝两末端）,解离酶（作用于复制后的拷贝）,模式：,两大步,a),共合体形成,切口连接复制,b),拆分,靶位点的,DR,形成,2,、非复制型转座模式,供体上最终产生双链断裂,供体位点如不能被修复则有致,死效应,五、转座子的某些遗传学效应,P157,转座可以导致基因变异,插入操纵子位置可以影响操纵子下游基因表达,应用：,难以筛选的基因转移,基因定位标记,筛选插入突变,构建特殊菌株,克隆难以进行表型鉴定的基因,7.3.6,真核生物的转座成分,P152,自学,真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类：,a),转座机制与细菌的转座子类似,需要转座酶、两端的,IR,转座靶点序列随机，,遗传信息：,DNADNA,转座酶、转座因子两端的,IR,序列，,玉米的,Ac-Ds,元件、果蝇的,P,元件和,FB,元件等,b),转作机制类似逆转录病毒 真核生物特有的转座机制（逆转录转座）,遗传信息：,DNA,RNADNA,逆转录子转录成,RNA,然后反转录成,DNA,插入基因组，类似于逆转录病毒的作用,如：逆转录病毒、果蝇的,copia,元件、酵母的,Ty,元件,逆转录酶和整合酶，,P208,逆转录酶生物学意义：影响其他基因表达，介导基因重排，促进基因的流动,第 二 节 重组,DNA,技术,DNA Recombination Technique,重组,DNA,技术的发展史,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物。,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,一、相关概念,DNA,克隆,工具酶,目的基因,基因载体,二、基本原理及操作步骤,本节主要内容,一、重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone),来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为,克隆化,(cloning),，即,无性繁殖。,（一）,DNA,克隆,DNA,克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体,DNA,接合成一具有自我复制能力的,DNA,分子,复制子,(replicon),，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一,DNA,分子，也称基因克隆或重组,DNA (recombinant DNA),。,生物技术工程,:,基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,目的, 分离获得某一目的基因或,DNA,获得目的基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称,重组,DNA,技术。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,逆转录酶,T4DNA,连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),识别,DNA,的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类核酸内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,作用：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,， 保护自身,DNA,。,分类：,、,、,类,（,基因工程技术中常用的是,类,）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点：,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,粘端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为,同尾酶,。这两个相同的粘性末端称为,配伍未端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,（三）目的基因,cDNA (complementary DNA),基因组,DNA (genomic DNA),（四）基因载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,常用载体,质粒,DNA,噬菌体,DNA,病毒,DNA,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,载体的选择标准,能自主复制；,具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小，以容纳较大的外源,DNA,。,1.,质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,细菌染色体外的小型环状双链,DNA,分子。,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,2.,噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,pUC,系列,Multiple Cloning Sites,3.,柯斯质粒,(cosmid),pJB8,的物理图谱,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome, YAC),动物病毒,DNA,改造的载体,腺病毒载体,逆转录病毒载体,杆状病毒载体,其他,二、重组,DNA,技术基本原理,目的基因的获取,重组,DNA,导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,（一）目的基因的获取,1.,化学合成法,已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。,2.,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),3. cDNA,文库,(cDNA library),4.,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction, PCR),1.,化学合成法,由已知氨基酸序列推测可能的,DNA,序列,组织或细胞染色体,DNA,基因片段,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组,DNA,的集合,2.,基因组,DNA,文库,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体,DNA,限制酶部分消化,外源,DNA,与载体,DNA,混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA,片段,cos L,R cos,20 Kb,外源,DNA,片段,基因文库,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,3.,cDNA,文库,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组,DNA,或,cDNA,的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。,4.,聚合酶链反应（,PCR,）,模板,DNA,引物,4,种,dNTP,Taq DNA,聚合酶,含,Mg,2+,的缓冲液。,PCR,的反应体系,（,1,）,变性,，加热至,95 ,，使模板,DNA,解开成单链；,（,2,）,退火,，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；,（,3,）,延伸,，温度升至,72 ,，,DNA,聚合酶以,4,种,dNTP,为底物，在引物的,3-OH,上，合成与模板互补的,DNA,新链。,PCR,的基本反应步骤及原理,PCR,反应条件,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,PCR,反应的基本原理,（三）外源基因与载体的连接,1.,粘性末端连接,方式：,(1),同一限制酶切位点连接,(2),不同限制酶切位点连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.,平端连接,适用于：,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,3.,同聚物加尾连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3 T(T),n,T,T(T),n,T 3,5,5,3,3,5,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+ dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,4.,人工接头,(linker),连接,由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。,Eco,R,Eco,R,Eco,R,人工接头及其应用,CCGAATTCG,GGCTTAAGC,5,-,3-,Eco,R,受体菌条件,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,导入受体菌,（五）重组体的筛选,1.,直接选择法,(1),抗药性标记选择,(2),标志补救,(marker rescue),(3),分子杂交法,原位杂交,Southern,印迹,2.,免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,(,插入失活法,),抗药性标记选择,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补的检测,原位杂交,Southern,印迹,鸡的,肌球蛋白的克隆和检出,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为,小 结,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体菌,筛,筛选重组体,重组,DNA,技术操作的主要步骤,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组,DNA,cDNA,人工合成,PCR,产物,限制酶消化,开环载体,DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,表达体系的建立,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.,原核表达体系,（,E.coli,表达体系最为常用）,标准：,选择标志强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足,不宜表达真核基因组,DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、费钱,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体,pFASTBACI,的物理图谱,（一）疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF, EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,基因诊断,(genetic diagnosis),是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在,DNA,水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定,DNA,的异常,分离、扩增待测的,DNA,片断,标准,.,能正确扩增靶基因；,.,能准确区分单个碱基的差别；,.,本底或噪声低，不干扰,DNA,的鉴定,;,.,便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义,基因治疗,(gene therapy),是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式,体细胞基因治疗,(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗,(germ line gene therapy),1.,产前诊断,2.,携带者测试,3.,症候前诊断,4.,遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,复习思考题：,1.,概念：,（,1,）克隆（,2,）转化,（,3,）转位（,4,）基因工程,（,5,）转座（,6,）限制性核酸内切酶,（,7,）载体（,8,）,G,文库,（,9,）质粒（,10,）,c,文库,2.,简述基因工程的基本过程。,3.,简述目的基因的主要来源或途径。,DNA,克隆及相关的基因操作技术及其应用在后续章节专门讲授,1,、,Genius only means hard-working all ones life,. (Mendeleyer, Russian Chemist),天才只意味着终身不懈的努力。,20.8.58.5.202011:0311:03:10Aug-2011:03,2,、,Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity.,(Richard Nixon, American President ),命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二二年八月五日,2020,年,8,月,5,日星期三,3,、,Patience is bitter, but its fruit is sweet.,(Jean Jacques Rousseau , French thinker),忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。,11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.2020,4,、,All that you do, do with your might; things done by halves are never done right.,-R.H. Stoddard, American poet,做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行,8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:10,5,、,You have to believe in yourself. Thats the secret of success.,-Charles Chaplin,人必须相信自己，这是成功的秘诀。,-Wednesday, August 5, 2020August 20Wednesday, August 5, 20208/5/2020,6,、,Almost any situation-good or bad-is affected by the attitude we bring to.,-Lucius Annaus Seneca,差不多任何一种处境,-,无论是好是坏,-,都受到我们对待处境态度的影响。,11,时,3,分,11,时,3,分,5-Aug-208.5.2020,7,、,Although the world is full of suffering, it is full also of the overcoming of it.,-Hellen Keller, American writer,虽然世界多苦难，但是苦难总是能战胜的。,20.8.520.8.520.8.5,。,2020,年,8,月,5,日星期三二二年八月五日,8,、,For man is man and master of his fate.-,-Tennyson,人就是人，是自己命运的主人,11:0311:03:108.5.2020Wednesday, August 5, 2020,9,、,When success comes in the door, it seems, love often goes out the window.-,-Joyce Brothers,成功来到门前时，爱情往往就走出了窗外。,11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.2020,10,、,Life is measured by thought and action, not by time.,Lubbock,衡量生命的尺度是思想和行为，而不是时间。,8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:10,11,、,To make a lasting marriage we have to overcome self-centeredness.,要使婚姻长久，就需克服自我中心意识。,Wednesday, August 5, 2020August 20Wednesday, August 5, 20208/5/2020,12,、,Treat other people as you hope they will treat you.,你希望别人如何对待你，你就如何对待别人。,11,时,3,分,11,时,3,分,5-Aug-208.5.2020,13,、,To do whatever needs to be done to preserve this last and greatest bastion of,freedom.,(Ronald Reagan , American President ),为了保住这最后的、最伟大的自由堡垒，我们必须尽我们所能。20.8.520.8.5,Wednesday, August 5, 2020,14,、,Where there is a will , there is a way .,( Thomas Edison , American inventor ),有志者，事竟成。11:01:1911:01:1911:01,8/5/2020 11:01:19 AM,15,、,Every man is the master of his own fortune.,-Richard Steele,每个人都主宰自己的命运。20.8.511:01:1911:01,Aug-205-Aug-20,16,、,As selfishness and complaint cloud the mind, so love with its joy clears and sharpens the vision.,-Helen Keller,自私和抱怨是心灵的阴暗，愉快的爱则使视野明朗开阔。11:01:1911:01:1911:01,Wednesday, August 5, 2020,17,、,Do not, for one repulse, give up the purpose that you resolved to effect.,-Willian Shakespeare ,British dramatist,不要只因一次失败，就放弃你原来决心想达到的目的。20.8.520.8.511:01:1911:01:19,August 5, 2020,18,、,There is no absolute success in the world, only constant progress.,世界上的事没有绝对成功，只有不断的进步。2020年8月5日星期三上午11时1分19秒11:01:1920.8.5,19,、,Nothing is more fatal to happiness than the remembrance of happiness.,没有什么比回忆幸福更令人痛苦的了。2020年8月上午11时1分20.8.511:01,August 5, 2020,20,、,No man is happy who does not think himself so.,Publilius Syrus,认为自己不幸福的人就不会幸福。2020年8月5日星期三11时1分19秒11:01:19,5 August 2020,21,、,The emperor treats talent as tools, using their strongpoint to his advantage.,君子用人如器，各取所长。上午11时1分19秒上午11时1分11:01:1920.8.5,谢谢观看,THE END,