第2章酶促反应动力学课件

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物反应工程原理,第二章 酶促反应动力学,主要内容,1.,酶与固定化酶的性质,2.,利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程,3.,操作参数（温度与,pH,）对酶促反应的影响,4.,酶的抑制动力学,5.,固定化酶促反应动力学,6.,酶的失活动力学,了解酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学行为。,掌握零级、一级和米氏酶促反应动力学方程及其应用原理,熟悉酶促反应与化学反应的区别与特点,具备分析固定化酶反应过程中的传质与反应和固定化酶动力学反应不同阶段特性的能力,目的,学习的目的,了解抑制酶促反应动力学的特征,2,-1,酶与固定化酶的性质,酶,固定化酶,熟悉酶促反应与一般化学反应的区别与特点,掌握酶促反应过程中的一些基本概念,2-1-1,酶,生物反应工程是建立在生物科学与工程学基础之上。,生物反应离不开生物催化剂，因此首先应深入了解生物催化剂的基本概念。,酶是生物体为其自身代谢活动而产生的生物催化剂，除具有催化活性的,RNA,外基本都是蛋白质。,基本概念：,1),为什么称酶促反应？不说酶反应？,2),生物催化剂与化学催化剂具有相同的性质吗？,3,）购买酶时，是购买的活力还是什么？,酶的分类,国际生物化学联合会,(International Union of Biochemistry IUB),国际酶学委员会,(Enzyme Commission, EC),于,1961,年提出的酶的分类与命名方案的规定，按照酶进行催化反应的类型，可将酶分为六类：,1,）氧化还原酶类,(oxidoreductases),2,）转移酶类,(transferases),3,）水解酶类,(hydrolases),4,）裂合酶,(lyases),5,）异构酶,(isomerases),6,）连接（或合成）酶,(ligase, synthetases),酶的分类,例如：,第一亚类（氧化基团是,CHOH,）,在此亚亚类中的顺序号,第一大类（氧化还原酶）,第一亚亚类（,NAD,为,H,的受体）,编号,EC1.1.1.1,（已醇脱氢酶）,酶的催化共性,1,）,降低反应的活化能,如过氧化氢的分解，,无催化剂时反应活化能为,75.31kJ/mol,，加入过氧化氢酶后，过氧化氢分解反应的活化能为,8.37kJ/mol,；,2,）,加快反应速率,一般非酶催化反应速率太低，不易观察，酶催化反应速率和在相同,pH,值与温度下非酶催化反应速率可直接比较的例子很少。已知己糖激酶可加快反应速率，大于,10,10,倍；乙醇脱氢酶大于,210,8,倍。,酶的催化共性,3,）,不能改变反应的平衡常数，只能加快反应达到平衡的速度,另外,，反应中酶的立体结构和离子价态可能发生变化，但在反应结束时，酶本身一般不消耗，并恢复到原来状态。,酶的生物催化特性,1,）很强的专一性,底物专一性,(substrate specificity),反应专一性,(reaction specificity),立体专一性,(stereo specificity),2,）,较高的催化效率,酶的催化反应是在常温、常压等温和条件下进行的，相对于此条件下的化学反应，催化效率高。,另外，酶易失活；酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关；酶活性受到浓度参数、激素的量、反馈抑制等因素的调节和控制。,酶催化活力的定义,酶的催化效率是用酶活力表示,在一定条件（如,25,，在具有最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和,pH,值）下，,min,能催化,mol,底物转化为产物时所需要的酶量为一个国际单位（,IU,）。,1972,年国际酶学委员会推荐一个新的酶活力国际单位,katal,，符号为,kat,。,kat,的定义：在最适条件下,1,s,催化,mol,底物转化的酶量。,1 ka,t,= 1mol/s = 60,10,6,mol/min = 6,10,7,IU,1 IU = 1,mol/min = 1/60,mol/s = 1/60,kat = 16.67,10,-9,kat,酶的比活力为每千克酶所具有的,katal,数，即,ka,t,/kg,。,酶的调节功能,酶是生物催化剂，而且具有调节功能。生物反应中的有序性受多方面因素调节与控制，而酶活力的控制是代谢调节作用的主要方式。,酶活力的调节方式,：,1,）,酶浓度的调节；,2,）激素调节；,3,）共价修饰调节；,4,）限制性蛋白水解作用与酶活性调控；,5,）抑制剂调节；,6,）反馈调节；,7,）金属离子和其它小分子化合物的调节等。,酶还是一类多用途的催化剂，通过特殊操作，可产生具有两种或更多种不同功能（或活性中心）的酶。此外，酶的区域化（,compartmentation,）和多酶复合体等都和酶活力的调节控制有密切关系。,引起酶失活的原因,1,）酶活性中心特定氨基酸（或其它）残基被化学修饰；,2,）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物相结合；,3,）酶的高级结构发生变化，相对而言是一种宏观变化；,4,）多肽链的断裂，可以说是一种,“,激烈的分解作用,”,；,5,）,确保酶活力稳定的方法,低温（冷冻保存）,添加盐类,添加底物,添加有机溶剂,化学修饰,加入强变性剂,加入蛋白质,结晶化,固定化,难以被化学物质或蛋白酶等破坏,例如加入高浓度硫铵后，增强酶高级结构的稳定性,保护酶的活性中心，有利于酶分子高级结构的稳定,酶分子构象刚性增强等,稳定酶的高级结构，保护酶的活性中心,只要保留一级结构，仍可再生,加入清蛋白（,albumin,）等用于保护在稀薄状态下易发生变性失活的酶类,有利于高级结构的稳定,防止或减少蛋白酶的作用,稳定化方法,稳定的原因,酶应用的特点,1),酶的稳定性及应用特点,2),酶是以活力、而不是以质量购销的,3),酶有不同的质量等级：,工业用酶,食品用酶,医药用酶,实际应用酶时应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。,酶应用的特点,酶应用的特点,酶应用的特点,酶应用的特点,经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。,工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时也在有机溶剂中进行。,酶应用的特点,酶在有机溶剂中的优点：,溶解度较大，,且其,热稳定性和储存稳定性比在水中有明显提高；,某些反应过程的热力学平衡可以向期望的方向移动，可以发生水溶液中不可能进行的反应，如脂肪酶催化酯交换和酯合成反应等；,酶分子构象表现出比在水溶液中更有刚性的特点，因而可以通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些选择性；,产物的分离与纯化比在水中容易；,另外酶不溶于有机溶剂因此有利于酶的回收与再利用等。,酶应用的特点,有机溶剂中，猪胰脂肪酶催化正己酸和无水乙醇合成己酸乙酯的反应：,以环己烷为反应介质,正己酸浓度,0. 6 m o l/L, n(,正己酸,),：,n(,无水乙醇,) = 1,：,1.25,加酶量,15 g /L,反应温度,37,反应,24 h,后,产率达到,90.5%,。,2-1-2,固定化酶,1.,固定化酶的基本概念,2.,酶固定化的方法,3.,固定化酶的性质,1.,固定化酶的基本概念,固定化酶,通过,物理或化学,的方法使溶液酶,结合在不溶于水的载体上,，或,被限制在有限空间内,，能与反应液分离，保留在反应器内或能够被回收并反复利用，,不溶于水,但仍具有酶活力的酶。,固定化酶的发展史,Nelson,和,Griffin,首先发现酵母蔗糖酶能被骨碳粉末吸附，并在吸附状态下具有催化活性。,召开第一次国际酶工程会议，确定固定化酶的定义。,日本学者千叶一郎等成功地将固定化氨基酸酰化酶应用于,DL-,氨基酸拆分上连续化工业生产,L-,氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。,1916,年,1969,年,1971,年,出现固定化细胞技术,1976,年法国首次固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。,1978,年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶。,20,世纪,70,年代后期,20,世纪,80,年代,出现固定化原生质体技术,1982,年日本首次用固定化原生质体生产啤谷氨酸，取得进展。,国内：,1986,年天津科技大学程志娟等人用固定化己酸菌提高浓香型白酒质量，其成果获得国家科技进步奖。,固定化酶的历史沿革,固定化酶的商业化应用：,1),氨基酰化酶,1969,年日本田边制药公司在世界上首次商业化应用的固定化酶用于,DL-,氨基酸拆分，实现了,L-,氨基酸连续生产。,2)-,半乳糖苷酶,又称乳糖酶，可用于水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖。采用固定化乳糖酶可连续生产低乳糖乳。,3),天冬氨酸-,-,脱羧酶,固定化天冬氨酸-,-,脱羧酶工业化生产,L-,丙氨酸。,固定化酶的历史沿革,4),天冬氨酸酶,利用天冬氨酸酶将延胡索酸转化生产,L-,天冬氨酸。,5),青霉素酰化酶,医药工业上广泛应用的一种固定化酶，可用多种方法固定化。,1973,年已工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢霉素。,6),延胡索酸酶,固定化延胡索酸酶生产,L-,苹果酸。,固定化酶的历史沿革,7),葡萄糖异构酶,世界上生产规模最大的固定化酶。固定化葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，连续生产果葡糖浆。,（,活性二羰基物质,）,葡萄糖异构酶,优质淀粉,果葡糖浆,固定化酶的优缺点,优点,容易从反应体系中分离,可以重复使用,机械强度和稳定性增加,便于连续化、自动化生产,缺点,酶活力损失,初始投资加大,只适用于可溶性底物,不适用于多酶反应,反应受传质速率影响,2.,酶固定化的方法,物理吸附法,:,吸附于不溶性载体,载体结合法 离子结合法：通过离子键结合,共价结合法：通过共价键结合,交联法,通过双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联,格子型：包埋在高分子凝胶细微网格中,包埋法,微胶囊：包埋在高分子半透膜中,酶固定化的方法,酶固定化方法示意图,（,1,）离子结合,（,2,）共价结合,（,3,）交联,（,4,）聚合物包埋,（,5,）疏水作用,（,6,）脂质体包埋,（,7,）微胶囊,载体结合法,交联法,酶与具有两个或两个以上官能团的试剂反应,戊二醛,特点,E,O,E,E,O,O,O,E,（,1,）,不需要载体；,（,2,）,反应剧烈，酶活收率低；,（,3,）,结合牢固。,包埋法,将酶包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内,聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、琼脂,特点,（,1,）,只适合于底物和产物均为小分子物质的酶的固定化,（,2,）,酶活收率高,（,3,）,制备成本高,聚合,格子型固定化酶,丙烯酰胺,交联剂,酶,酶固定化方法的比较,特性,物理吸附法,离子结合法,共价结合法,交联法,包埋法,制备,易,易,难,难,易,结合力,弱,中,强,强,强,酶活,高,高,中,中,高,底物专一性,无变化,无变化,有变化,有变化,无变化,再生,可能,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,低,中,高,中,3.,固定化酶的性质,由于固定化常常是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。,固定化酶的性质,底物专一性的改变,稳定性增强,最适,pH,值和最适温度变化,动力学参数的变化,讨 论,进行酶促反应机理研究是否有必要进行酶的固定化？,小 结,酶不仅是一生物催化剂，具有一般化学催化剂的所有功能，而且是具有生物代谢调节功能，其在生物反应过程中具有不可替代的作用。,只要了解了酶的基本性质，并遵从其性质而应用酶，酶分子是相当稳定的。,固定化酶是提高酶应用效率的有效方法之一。,思考题,简述酶的催化特性与调节功能。,在一个实际的生物催化过程中如何确保生物催化剂（如酶）的稳定性，并提高催化效率？,酶在应用过程中有哪些不同于化学催化剂和微生物作为生物催化剂的地方？,为什么要固定化酶？进行生物酶催化机理研究时，采用固定化酶是否更有利于清楚了解催化过程机理？,生物反应工程原理,第二章 酶促反应动力学,主要内容,1.,酶与固定化酶的性质,2.,利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程,3.,操作参数（温度与,pH,）对酶促反应的影响,4.,酶的抑制动力学,5.,固定化酶促反应动力学,6.,酶的失活动力学,学习酶促反应动力学的目的,酶促反应,(Enzymatic reaction),是生物反应的基础。在生物化学课程中我们学习了酶促反应动力学，为什么这里我们还要讲述、学习呢？,对于商业化酶促反应过程，主要研究是对酶促反应速率规律进行的定性或定量的描述，建立可靠的反应动力学方程，进而确定适宜的操作条件。,酶促反应的特征,基于酶自身的特性，酶促反应是在常温、常压、中性范围（个别除外）条件下进行的，与一些化学反应相比，省能且效率较高；,由于酶促反应的专一性，无或少有副产物生成，有利于提取操作；,与微生物反应相比，反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。,酶促反应的不足,酶促反应多限于一步或几步较简单的生化反应过程，与微生物反应体系相比，在经济上有时并不理想；,虽然酶促反应条件比较温和，但一般周期较长。因此有发生杂菌污染的可能；,固定化酶反应体系有许多优于游离酶促反应体系的优点，但固定化酶并非一定就是最优质的生物催化剂。,酶促反应与化学反应的主要区别,酶促反应 化学反应,反应条件 温和 激烈,反应时间 较长 时间短,生物相容性 好 较差,反应体积 较大 较小,可持续性 较强 较差,与环境友好性 较强 较差,还有什么？,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,影响酶促反应的主要因素有：,浓度因素，包括酶浓度、底物浓度等；,外部因素,(,环境因素,),，包括温度、压力、溶液的介电常数与离子强度、,pH,等；,内部因素,(,结构因素,),，包括底物及效应物浓度、酶的结构等。,其中影响酶促反应的最基本的是浓度因素。从浓度因素实验可求得速率常数，而速率常数为内外因素所左右，这是单相酶促反应动力学的核心内容。,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,可采用化学反应动力学方法建立相应的动力学方程。如果酶促反应速率与底物浓度无关，此时为零级反应,式中：,S,底物浓度；,r,max,最大反应速率,例如：氨在催化剂表面分解为氮气和氢气的反应,（,1,）,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,当反应速率与底物浓度的一次方成正比，称为一级反应。即酶催化,A,B,的过程,式中：,k,1,一级反应速率常数；,a,0,底物,A,的初始浓度；,b t,时产物,B,的浓度。,（,2,）,例如：有机物的分解，放射性元素衰变。,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,相应的二级反应，即,A + B C,式中：,k,2,二级反应速率常数；,a,0, b,0,底物,A,和底物,B,的初始浓度；,c t,时产物,C,的浓度。,（,3,）式积分可得,通过作图可求出,k,2,。,（,4,）,（,3,）,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,式中：,a,、,b,、,c,A,、,B,、,C,的浓度；,k,1,、,k,2,各步的反应速率常数。,对连锁的酶促反应，,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,如果,A,的初始浓度为,a,0,，,B,和,C,的初始浓度为,0,，并且,，则可求得,例 题,例题,1:,卵状甲单胞菌在分批式反应中先将葡萄糖转变为葡萄糖内脂，再转化为葡萄糖酸。此反应为一级反应，反应式如下：,求中间产物,(,葡萄糖内酯,),浓度达最大时所需的时间,t,max,及其最大浓度值,L,max,。已知反应常数,k,1,和,k,2,分别为,0.87h,-1,和,0.7h,-1,。,G,0,(,初始葡萄糖浓度,)=38mg/ml,。,例 题,【,解,】,因为,所以,所以,因为,例 题,即当,t,max,=1.28h,时，,L,物浓度达到最大值为,15.5g/L,。,当,L,物达到最大值时，此时,，所以,2,-,2-1 酶促反应动力学基础,何为限速阶段？,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,1.,米氏方程,根据酶底物中间复合物假说，对单底物酶促反应，其反应机制可表示为：,根据质量作用定律，,P,的生成速度可表示为,e,free,S x e,free,P,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,三点假设（快速平衡法）,S e,free,，,S,底物浓度不变,;,不考虑,P + E ES,这个可逆反应的存在。产物,P,为零，即反应为初始状态,;,ES E + P,是整个反应的限速阶段，也就是说,E + S = ES,的可逆反应在初速度测定时间内已达到平衡。,ES,分解生成产物的速度不足以破坏这个平衡。,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,式中：,r,s,底物消耗速度（负号表示减少）,；,r,p,产物生成速率,；,K,s,平衡常数,其又称饱和常数,。,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,稳态法推导动力学方程几点假设：,同快速平衡法,同快速平衡法,x,的生成速率与,x,的消失速率相等，达到动态平衡，即所谓,“,稳态,”,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,几点讨论：,Km,与,Ks,之间关系为,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,当,S k,+2,时，相对,S,讲，呈零级反应特征,当,S,接近,Km,时，反应体系随底物浓度而变动于零级和一级反应之间。,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,r,r,max,r,max,/2,K,m,C,S,图,1,酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,1,/,K,m,1/,r,max,1,r,斜率-,K,m,/r,max,1,/,C,S,图,2,双倒数法求解,K,m,和,r,max,双倒数法,(Linewear Burk):,对米氏方程两侧取倒数，得,以,作图，得一直线。根据直线斜率和截距可计算出,K,m,和,r,max,。,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,生物化学中的酶促反应与工业酶促反应的异同点,生物化学中酶促反应 工业酶促反应,反应速度,初速度,平均速度,传质影响 无 有,反应时间 短时间 长时间,目的 了解反应机理 获得反应速率,提高生产效率,还有什么？,2,-,2-2,单底物酶促反应动力学,工业酶促反应中人们更关心的是什么？,反应时间与底物转化率的关系,基于,t=0,，,S=S,0,初值积分得,例,题,例题,2,：将底物和酶加入到酶反应器中，经反应，底物的转化率为,90%,时，空时为多少？已知反应速率方程为,例,题,【,解,】,当,e,0,= 0.001mol/L,时，反应速率是,，,底物的,90%,转化为产物时,在反应器中,即,积分后得到,例,题,例题,3:,一般，酶促反应中酶的浓度较之底物浓度低很多，但当采用膜型生物反应器（细节见第七章），且采用高分子底物，发现米氏常数随酶浓度而变化。基于此确立相应的反应模型与酶促反应的动学方程。,例,题,【,解,】,由题意，反应模型可写成如下：,第一阶段：,第二阶段：,第一阶段反应的解离平衡常数,K,为：,酶及其它物质的物料平衡算式为：,其中，,t,表示酶的总量。一般,ESS,，但当酶浓,度较高时，,ESS,。,（,1,）,（,2,）,（,3,）,例,题,解之，得,将（,2,）式和（,3,）式代入（,1,）式，得,即,(4),例,题,若第二阶段为限速阶段，则：,将（,4,）式带入（,5,）式,由式（,8,）可知，米氏常数随酶浓度的增加而增大。一般反应速度有可能会酶浓度增加而增大。当然也有不增加的例子。由本题可知，酶的浓度相对于底物浓度高时，酶的浓度是不可忽视的因素。,(5),(6),(7),其中,(8),小 结,1.,米氏方程是一个理论性方程，是当酶促反应无传质影响下才能够成立，是实际生物反应中的一个特例。,2.,找出限速阶段是提高反应速率的关键。,3.,针对工业规模的酶促反应，人们更关心的是反应时间与转化率之间的关系。,思考题,1.,简述酶促反应的特征及其与化学反应的主要区别？,2 .,应用直线作图法（,LineweaverBurk,法；,Haneswoolf,法；,EadieHofstee,法和积分法）求取米氏方程中的动力学参数,K,s,和,r,max,，并比较由各种方法所得结果的误差大小。,3.,假设单底物,S,生成产物,P,的酶促反应机理式如,(1),式，试建立该可逆酶促反应,(Reversible enzyme reaction),动力学方程。,e,、,S,、,x,和,P,分别是与,(1),式对应项的浓度。,e S X e P,(1),生物反应工程原理,第二章 酶促反应动力学,1.,酶与固定化酶的性质,2.,利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程,3.,操作参数（温度与,pH,）对酶促反应的影响,4.,酶的抑制动力学,5.,固定化酶促反应动力学,6.,酶的失活动力学,主要内容,2,-3,操作参数对酶促反应的影响,影响酶促反应的操作参数有很多，主要有pH和温度。任何酶促反应都是在一定pH值和温度下进行。温度或pH对酶促反应的影响有两方面含意，一是对酶稳定性的影响，二是对酶活性的影响。,2.3.1 pH,的影响,图2-3猪胰脏,淀粉酶稳定性和活力与pH的关系曲线,：酶的稳定性pH曲线；,：酶活力pH曲线,图2-3中酶的稳定性pH曲线呈台型；酶的活力（反应速度）pH曲线呈钟形，酶活力pH曲线处于酶稳定性pH曲线内侧。,2.3.1 pH,的影响,针对pH值与酶活力的关系，Michaelis提出三状态模型，其要点是：处于解离活性状态的酶记为EH,-,，由活性状态转入无活性状态时的酸性形式记为EH,2,，碱性解离形式记为E,2-,，三种状态的相互关系为,2.3.1 pH,的影响,当底物S的解离状态不变；反应速率控制步骤为EHS,-,生成产物P的过程。相应的反应机理式为,k,cat,k,cat,k,cat,2.3.1 pH,的影响,由酶催化反应动力学的原理，有下述基本关系：,2.3.1 pH,的影响,若定义,式中：,电离平衡常数,H,氢离子浓度,底物浓度,2.3.1 pH,的影响,可得,其中,由上式可以看出，f,1,和f,均与p值有关。图3-3 表示了p值的变化对反应速率相对值的影响。,2.3.2,温度的影响,2.3.2,温度的影响,多数酶促反应的反应速度常数,与温度的关系，可用Arrhenius 方程来表达，即,式中,:,A,指前因子,E,a,反应活化能,R,气体常数,T,绝对温度,2.3.2,温度的影响,以lgk,+2,对1/T作图，可得一直线，由直线的斜率可求得活化能E,a,值（图2-4中的（a）直线）。,Arrhenius方程原用于描述温度对化学反应的影响，仅在较低温度范围内才适用酶促反应。这是由于在酶促反应中，随温度上升，反应若遵循 （E,a,为正值），反应速率会不断增大，同时酶的热失活速率也随之加大，两种作用相加的结果，如图2-4中（b）曲线所示。,图2-4 酶促反应速度的Arrhenius 图解,a.肌球蛋白为催化剂水解ATP反应,b.过氧化氢酶的H,2,O分解反应,2.3.2,温度的影响,当酶促反应服从快速平衡机理时，K,S,（K,m,）与温度的关系可认为服从Van,t-Hoff方程，即,式中，H为反应热。通过上式可求出酶促反应的反应热H。,2.3.2,温度的影响,例题：,有人研究了不同温度对酶的稳定性与酶活力的影响，得到如下图所示结果。基于此，他得到结论是：该酶在,50,以下是稳定的，并且最适反应温度为,30,。这一结论正确与否，请说明。,（,a,）无底物存在时，保温,10min,后残存活力,（,b,）在,0.5M,底物存在下,保温,10min,后产物生成量,2.3.2,温度的影响,答：（,1,）酶的稳定性受温度和时间的双重影响，其函数表达式为,表明温度和时间对酶稳定性的双重影响。在同一温度下，不同的保温时间残存酶活力有极大差异。图（,a,）中不同温度下保温,10min,后残余酶活力曲线只表明，在保温时间为,10min,时，酶在,50,以下是稳定的，而并不能得出“酶在,50,以下是稳定的”这一结论。因为不同的保温时间必将对酶的稳定性产生影响。,2.3.2,温度的影响,（,2,）一定的酶促反应都是由正向反应与酶的失活反应的复合。当时间一定，随温度的升高，反应速率增大，转化率提高，但当温度高于某一值时，由于酶的热失活速率加快，当快于酶促反应速率上升的速度时，酶的总反应速率下降，最终降为零。 对某一反应时间，就有一与最高转化率对应的温度，该温度称为最适温度。不同的反应时间，有不同的最适温度。最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。图（,b,）只表明反应时间为,10min,时，酶的最适反应温度为,35,，但并不能笼统地说酶的最适反应温度为,35,，因为如果反应时间变化，酶的最适反应温度将发生变化。,2,-4,酶的抑制动力学,抑制剂对酶促反应速率的影响,失活作用,抑制作用,竞争性抑制,非竞争性抑制,2,-4,酶的抑制动力学,竞争性抑制,非竞争性抑制,S,I,I,E,S,E,2,-4,酶的抑制动力学,竞争性抑制,Vs.,非竞争性抑制,竞争性抑制：反应体系中存在与底物结构相类似的物质，该物质也能与酶的活性部位结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶促反应速率下降；,非竞争性抑制：抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，且这种结合与底物的结合无竞争关系；,2,-4-1,竞争性抑制酶促反应,竞争性抑制反应机理：,k,cat,2,-4-1,竞争性抑制酶促反应,快速平衡法推导动力学方程：,解之，得,式中,:,2,-4-1,竞争性抑制酶促反应,采用稳态法推导动力学方程,：,2,-4-1,竞争性抑制酶促反应,解之，得,式中,:,小 结,温度或pH对酶促反应的影响有两方面含意，一是对酶稳定性的影响，二是对酶活性的影响。,2.,竞争性抑制的酶促反应动力学方程与无抑制的酶促反应动力学方程具有相似的形式，最大反应速率没有变化，只是米氏常数发生改变。,思考题,在,pH,对酶促反应速率影响的研究中，试证明对任一底物浓度,S,，产物生成速率,r,P,与,pH,的相关性为一左右对称的钟形曲线。,2.,某酶反应机理为,若假定上述反应机理式中，,k,+1,k,cat,，,k,-1,k,cat,，试推导其速率方程。,生物反应工程原理,第二章 酶促反应动力学,1.,酶与固定化酶的性质,2.,利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程,3.,操作参数（温度与,pH,）对酶促反应的影响,4.,酶的抑制动力学,5.,固定化酶促反应动力学,6.,酶的失活动力学,主要内容,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,非竞争性抑制反应机理：,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,快速平衡法推导动力学方程：,解之，得,式中,:,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,稳态法推导动力学方程：,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,解之，得,式中,:,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,竞争性抑制 非竞争性抑制,令,可变形为,:,可变形为,:,令,2,-4-2,非竞争性抑制酶促反应,竞争性抑制 非竞争性抑制,2,-4-3,产物抑制动力学,产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。,反应机理：,2,-4-3,产物抑制动力学,快速平衡法推导动力学方程,:,2,-4-3,产物抑制动力学,式中,:,解之,得,2,-4-3,产物抑制动力学,稳态法推导动力学方程,:,2,-4-3,产物抑制动力学,解之,得,式中,:,可见,产物抑制属于竞争性抑制,2,-4-4,底物抑制动力学,底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。,C,S,r,2,-4-4,底物抑制动力学,底物抑制反应机理：,2,-4-4,底物抑制动力学,快速平衡法推导动学方程：,2,-4-4,底物抑制动力学,式中,:,解之,得,例题,例,1,：在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为,2.2,10-1mmol/L,的抑制剂，并测定其初始反应速率，数据见下表,用,L-B,法确定其抑制类型及其反应动力学参数值,底物初始浓度,Cs,0,/(mmol/L),无抑制时速率,r,s0,/mmol/(L,min),有抑制时速率,r,I0,/mmol/(L,min),0.10,28,18,0.15,36,24,0.20,43,30,0.50,63,51,0.70,74,63,例题,解：假定有抑制剂存在时，其抑制机理为竞争性抑制，可根据,来判断抑制类型和求其动力学参数。,将实验数据分别取其倒数，,1/Cs,0,1/r,s0,1/r,I0,10,3.57,10,-2,5.56,10,-2,6.67,2.78,10,-2,4.17,10,-2,5,2.33,10,-2,3.33,10,-2,2,1.59,10,-2,1.96,10,-2,1.43,1.35,10,-2,1.59,10,-2,例题,以,L-B,法作图，得到如图,1c,所示两条直线，并在纵轴有共同交点，表明假设为竞争性抑制正确。,根据图,1c,所示，可得,r,max,=100 mmol/(L,min),Km=0.24 (mmol/L),Km,*,=0.44(mmol/L),K,I,=0.27(mmol/L),例,题,【,例,3,】,某酶的,K,m,值为,610,-5,mol/L,，如果,r,max,值为,310,-5,mol/,（,Lmin,），在底物浓度为,310,-4,mol/L,和在（,1,）竞争性抑制剂和（,2,）非竞争性抑制剂的浓度均为,610,-4,mol/L,情况下，其反应速率分别为多大？（,3,）假定在上述情况下,K,I,值均为,310,-4,mol/L,，则在上述两种抑制情况下的抑制程度各有多大？,例,题,【,解,】,（,1,）对竞争性抑制，由竞争性抑制方程式，可列出下式,mol/,（,L min,）,例,题,（,2,）对非竞争性抑制，由非竞争性抑制方程式，可列出下式,mol/,（,L min,）,例,题,（,3,）求抑制程度,当无抑制剂存在时的反应速率,所以上述两种抑制的抑制程度应分别为,竞争性抑制,非竞争性抑制,mol/,（,L min,）,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,一般的多底物酶促反应可表示为：,这里讨论：双底物双产物情况,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,反应机制：,关键问题：底物,A,、,B,哪个先和酶结合？,任何一个都有可能先与酶结合 （随机机制）,A,先与酶结合或,B,先与酶结合,两底物同时与酶结合 （可能性极小）,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,随机机制（分支机制）,E,EB,EA,EAB,EPQ,EP,EQ,E,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,（不形成三元复合物）反应模型,EA,E,A,A,P,P,B,B,EQ,Q,Q,E,EG,（,EG,：修饰过的酶 ）,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,简单机制,E,EA,EAB,A,A,B,B,EPQ,Q,Q,EP,E,P,P,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,双底物酶促反应动力学,反应机理：,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,2,-4,-,5,多底物酶促反应动力学,解之，得,式中：,小 结,对于竞争性抑制来说，增加底物浓度可减弱抑制剂的影响,，但对于非竞争性抑制来说，及时增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。,多底物的酶促反应实际上可以看成一组反应，究竟是哪一个底物与酶先结合是影响酶促反应动力学的关键问题。,思考题,依据（,3-39,）式，,利用稳态法建立,n,个底物分子与酶活性中心结合的竞争性抑制动力学方程是,酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的合成，从而降低了酶促反应的速度。基于此，试建立产物抑制时的酶促反应动力学方程,。,生物反应工程原理,第二章 酶促反应动力学,主要内容,1.,酶与固定化酶的性质,2.,利用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程,3.,操作参数（温度与,pH,）对酶促反应的影响,4.,酶的抑制动力学,5.,固定化酶促反应动力学,6.,酶的失活动力学,本节内容,酶的固定化技术定义,酶和细胞固定化方法,固定化对酶性质的影响,影响固定化酶促反应的主要因素,固定化酶催化反应动力学,固定化酶促反应动力学,固定化酶促反应动力学基础,外部扩散过程,内部扩散过程,固定化酶促反应中的过程分析,本讲内容,1.,酶的固定化技术定义,酶的固定化技术是将水溶酶分子通过静电吸附、共价键结合、包埋等方式，与载体如活性炭、离子交换树脂、角叉菜胶等材料制成固定化酶的技术。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化技术,固定化酶,水溶酶,水不溶性载体,2.,酶和细胞固定化方法,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,物理吸附法,载体结合法 离子结合法,共价结合法,交联法,格子型,包埋法,微胶囊,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,特性,物理吸附法,离子结合法,共价结合法,交联法,包埋法,制备,易,易,难,难,易,结合力,弱,中,强,强,强,酶活,高,高,中,中,高,底物专一性,无变化,无变化,有变化,有变化,无变化,再生,可能,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,低,中,高,中,为降低,固定化,酶的制造成本，要求酶,1,）生产成本低；,2,）不受季节、地区条件的限制；,3,）制造周期短，便于大规模生产等。,酶存在于微生物细胞内，其提取操作复杂、费力；,有些酶从微生物细胞中分离出来后不稳定；,有些酶的价格,高且,易失活。,因此，直接固定化微生物,细胞,。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化细胞的优点：,省去酶的提取精制操作，减少了起始投资；,固定化时酶活力损失小，对不利因素抗性强；,细胞保持原初生命活动状态，催化效率高；,不易受微生物作用，抗污染能力强；,多酶体系可催化系列反应，并且胞内辅因子可自动再生；,活性再生可在原位进行，操作稳定性好。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化细胞的不足,：,细胞内含有生物体全部代谢系统，产物纯度较低或有副产物生成；,微生物细胞,的,直径为,1,10,m,，酶分子直径仅,30,100A,，,当,达到同一产率，反应器体积比酶反应器体积大，或反应液的停留时间长；,细胞自溶作用及固定化细胞活性和稳定性,受,胞内蛋白质的不利影响；,细胞壁、膜的存在，增加了物质扩散的阻力。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶,（,或多酶复合体,）,固定化后，会引起酶性质的改变。其原因：,1,）,酶自身的变化活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化；,2,）,载体理化性质的影响固定化酶的周围形成对底物传递产生影响的扩散层或静电相互作用等。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,3.,固定化对酶性质的影响,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶活力的变化,酶的稳定性,最适温度的变化,最适,pH,值的变化,动力学参数（,米氏常数,K,m,）的变化,多数情况下比水溶酶活力小，其专一性也能发生改变。,胰蛋白酶可作用于高分子蛋白质，也可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，但对酪蛋白的作用仅为水溶酶的,3%,左右。,1),固定化后酶活力的变化,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,在固定化过程中，酶分子的空间构象发生变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；,固定化后，酶分子空间自由度受到限制,(,空间位阻,),，影响活性中心对底物的定位作用；,内扩散阻力阻止底物分子与活性中心的接近；,包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。,酶活力降低的原因：,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。,Merlose,曾选择,50,种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较。,2),固定化对酶稳定性的影响,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,某些酶对各种化学试剂的稳定性,酶,方法,试剂,保存活性,/%,溶液酶,固定,化酶,氨基,酰化酶,离子交换吸附法（,DEAE-,纤维素）,6mol/L,尿素,9,146,2mol/L,盐酸胍,49,117,1% SDS,1,35,胰蛋白酶,缩合偶联法,（,CM-,纤维素）,4mol/L n-,丙醇,55,138,3mol/L,尿素,60,120,大豆胰蛋白酶抑制剂,0,80,乙酰胆碱酯酶,包埋法,百治磷,(,一种有机磷农药）,0,49,葡萄糖,淀粉酶,物理吸附法,（活性炭）,0.002mol/L,醋酸汞,80,0,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,对苯二异氰酸酯固定化的葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶比间苯二异硫氰酸酯的稳定性高，在反复使用后仍然具有较高活力。,Enzyme and Microbial Technology,Volume 52, Issues 67, 10 May 2013, Pages 336343,对苯二异氰酸酯,间苯二异硫氰酸酯,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,硅烷,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,（,1,）热稳定性,水溶酶,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化酶对各种有机溶剂的稳定性的提高，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。,（,2,）对有机试剂及酶抑制剂的稳定性,（,3,）,pH,稳定性,固定化青霉素酰化酶在,pH 5.5-10.3,范围内稳定；水溶酶仅在,pH7.0-9.0,稳定。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化后酶分子与载体多点连接可防止酶分子伸展变形。,酶活力的缓慢释放。,抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。,固定化后酶稳定性提高的可能原因：,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶促反应最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。,固定化后，酶的热稳定性提高，最适温度也随之提高。,也有酶固定化后最适温度会降低。,固定化酶的最适温度受固定化方法和载体的影响。,3),固定化酶最适温度的变化,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,4),固定化酶最适,pH,的变化,pH,对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响,1-,固定化酶；,2-,水溶酶,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶固定化后，载体的带电性和酶催化反应产物的性质，引起酶促反应的最适,pH,变化。,将酶固定化于多聚阳离子,(Polycationic),性载体上时，最适,pH,向酸性一侧移动；,将酶固定化在多聚阴离子,(Polyanionic),性载体上时，最适,pH,向碱性一侧移动；,用不带电的载体固定化酶时，其最适,pH,一般无变化。,如果催化反应产物为酸性时，固定化酶的最适,pH,值要比游离酶的最适,pH,值低一些；产物为中性时，最适,pH,值一般无变化。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶结合电中性载体，由于扩散限制使,Km,值上升,；,载体与底物电荷相反，固定化酶的,Km,值降低；,载体与底物电荷相同，固定化酶的,Km,值增加；,固定化酶催化反应有扩散阻力时，,Km,值增加；,分配系数（后述）大于米氏常数，,Km,值下降；,Km,值减小，有利于固定化酶反应进行得更完全。,5),固定化酶米氏常数,(Km),的变化,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,ATP:,腺苷三磷酸；,BAA: N-,-,苯甲酰,-L-,精胺酰胺；,ATEE:,乙酰,-L-,酪氨酸乙酯；,BAEE,：,N-,-,苯甲酰,-L-,精氨酸乙酯,某些酶反应的,Km,和酶固定化后的,Km,酶,载体,底物,Km(Km)/mol/L,名称,电荷,名称,电荷,肌酸激酶,0,ATP,-,6.5,10,-4,-,氨基苯纤维素,0,ATP,-,8.0,10,-4,CM-,纤维素,-,ATP,-,7.0,10,-8,胰蛋白酶,0,BAA,+,6.8,10,-3,顺丁烯二酸,-,乙烯,-,BAA,+,2.0,10,-4,胰凝乳蛋白酶,0,ATEE,0,2.7,10,-4,CM-,纤维素,-,ATEE,0,5.6,10,-4,木瓜蛋白酶,0,BAEE,+,1.9,10,-2,-,氨基,-Phe-Leu,共聚物,+,BAEE,+,1.9,10,-2,无花果蛋白酶,0,BAEE,+,2.0,10,-2,CM-,纤维素,-,BAEE,+,2.0,10,-3,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化酶与水溶酶不同反应特性产生的原因：,（,1,）在酶的固定化过程中产生的；,（,2,）实际使用中由于传递阻力等因素引起的。,要预测固定化酶反应进行的状态，就必须了解固定化酶反应动力学特征及其参数与反应速率的关系。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,以包埋法固定化酶促反应为例，其反应历程由（,1,）底物由流体主体传递到固定化酶载体的外表面；（,2,）底物由外表面向载体内扩散；（,3,）进行酶促反应；（,4,）产物由内部扩散到载体外表面和（,5,）产物传递到流体主体五步组成。,当酶固定化于无孔载体的外表面，没有（,2,）和（,4,）两个阶段。,固定化酶反应是在物质传递和酶促反应两方面的影响下进行的。,图,1,固定化酶剖面图及浓度分布图,4.,影响固定化酶促反应的主要因素,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,分子构象的改变,位阻效应,微扰效应,分配效应,扩散限制,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,酶,底物,溶液中的游离酶,载体,构象改变,1),分子构象的改变,多出现于吸附法和共价偶联法的固定化酶中,载体,酶,底物,位阻效应,溶液中的游离酶,2),位阻效应,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,选择适宜的载体与固定化方法，可消除这种不利因素的影响。但这种效应难以定量描述。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化酶反应体系中的微环境与宏观环境,3),微扰效应,载体的亲水性、疏水性及介质的介电常数等的变化，改变紧邻固定化酶的环境区域，使酶的催化能力及酶对效应物做出调节反应的能力发生改变。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,4),分配效应（可用,Kp,定量描述）,分配效应是由于固定化载体与底物或效应物之间的疏水性、亲水性及静电作用所引起微环境（固定化酶紧邻的微观局部环境）和宏观环境之间物质的不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速率。,分配系数（,Kp,）,：载体内外底物,(,或其他物质,),浓度之比。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,多孔聚阴离子载体,底物,在多孔聚阴离子载体中,当底物带负电荷时，底物在微环境中的浓度将低于外部宏观环境。,当底物带正电荷时，底物在微环境中的浓度将高于外部宏观环境。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,固定化胰凝乳蛋白酶的活性,pH,曲线,固定化菠萝蛋白酶的,K,m,与离子强度的关系,疏水作用产生的分配效应,-,-,水溶菠萝蛋白酶,-o-,固定化菠萝蛋白酶,1,聚阴离子载体,2,水溶酶,3,聚阳离子载体,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,5),扩散限制,扩散限制是指底物、产物及其它效应物的迁移和传递速度所受到的一种限制。,一般水溶液及凝胶中的物质扩散系数很低，当酶的催化活性很高时，固定化酶的周围形成浓度梯度，使微环境和大环境中底物和产物的浓度有差别。,酶的催化反应速率一般很小，扩散限制的影响小或没有，此时酶促反应阶段成为整个反应的限速阶段。,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,不搅拌层,由于多孔载体中酶促反应与扩散过程几乎同时进行，故底物在载体内的浓度分布是非线性的。,底物,产物,多孔载体,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,同时考虑分配效应和扩散限制时，底物在固定化酶体系中的分布,2-5-1,固定化酶促反应动力学基础,图,2,不同的反应速率与参数及其相互关系,5.,固定化酶催化反应动力学,本征速率及本征动力学参数描绘酶的真实动力学特性。游离酶所反映的就是其本征行为；对固定化酶而言，如果底物和产物在微环境和宏观环境中的浓度相同，则此时观察到的动