实验13-琼脂糖凝胶电泳的原理和方法课件

44,琼脂糖凝胶电泳的,原理和方法,一、电泳方法的分类,按支持物的物理性状不同，区带电泳可为：,滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维）,薄膜,电位；,粉末,电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；,凝胶,电泳，如琼脂、,琼脂糖,、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等；,丝线,电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。,按支持物的装置形式不同，区带电泳可为：,平板式,电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式,；,垂直板式,电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳,；,垂直柱式,电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类,；,连续液动,电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直,。,概念：,以,琼脂糖凝胶,作支持体的电泳方式。,二、琼脂糖凝胶电泳,天然琼脂（,agar,）,:,又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（,agarose,）,琼脂胶（,agaropectin,）,天然琼脂,(agar),是一种多聚糖，主要由,琼脂糖,(,约占,80%),及,琼脂胶,组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的,中性物质,，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的,强酸性多糖,，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的,电渗,现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。,D-,半乳糖,3,，,6-,脱水,-L-,半乳糖,琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其,优点,如下：,(1),琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。,(2),琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大,(,约占,98-99%),，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。,(3),琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。,(4),电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,琼脂糖凝胶电泳的,缺点,：,(1),机械强度差，易破碎，浓度不能太低。,(2),易被细菌污染，不易保存，临用前配制。,(3),琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。,(4),与,PAGE,相比，分子筛作用小，区带少。,目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如,DNA,鉴定，,DNA,限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。,琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，,0.1g,蛋白质就可检出。,琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。,三、,DNA,的琼脂糖凝胶电泳,1.,核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系,(1)DNA,分子的大小：,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。,DNA,分子在高于等电点的,pH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于分子筛效应，即,DNA,分子本身的大小和构型。,在凝胶中，,DNA,片段迁移距离,(,迁移率,),与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。,但是当,DNA,分子大小超过,20kb,时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离,DNA,时，分子大小不宜超过此值。,(2),琼脂糖的浓度：,不同大小的,DNA,需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离,如下表所示,:,2.,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型,DNA,的移动速度次序为：,共价闭环,DNA,(covalently closed circular,，简称,cccDNA),直线,DNA,开环的双链环状,DNA,。当琼脂糖浓度太高时，环状,DNA(,一般为球形,),不能进入胶中，相对迁移率为,0(Rm=O),，而同等大小的直线双链,DNA(,刚性棒状,),则可以 长轴方向前进,(Rm,O),，由此可见，这,3,种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。,3.,电泳方法,(1),凝胶类型,用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型,(,平板型,),。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下,1-2mm,，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。,(2),缓冲液系统,缺少离子时，电流太小，,DNA,迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热 ，严重时，会造成胶熔化和,DNA,的变性。,常用的电泳缓冲液有,EDTA(pH8.0),和,Tris-,乙酸,(TAE),，,Tris-,硼酸,(TBE),或,Tris-,磷酸,(TPE),等 ，浓度约为,50mmol/L(pH7.5-7.8),。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。,TAE,缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。,TBE,浓溶液长期贮存会出现沉 淀，为避免此缺点，室温下贮存,5,溶液，用时稀释,10,倍。,0.5,工作液也可提供足够的缓冲能力。,(3),凝胶的制备,以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，冷却至,45-50,时灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。,(4),样品配制与加样,DNA,样品用适量,Tris-EDTA,缓冲液溶解，缓冲溶解液内含有,0.25%,溴酚蓝或其他指示染料， 含有,10%-15%,蔗糖或,5%-10%,甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生,U,形条带，可改用,2.5% Ficoll(,聚蔗糖,),代替蔗糖或甘油。,(5),电泳,琼脂糖凝胶分离大分子,DNA,实验条件的研究结果表明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性,DNA,分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的,DNA,片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离,DNA,片段的最大分辨率，电场强度不宜高于,5V/cm,。,电泳系统的温度对于,DNA,在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于,0.5%,时，为增加凝胶硬度，可在,4,，进行电泳。,(6),染色和拍照,常用荧光染料溴乙锭,(EB),染色，在紫外光下观察,DNA,条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。,注意,!,溴化乙锭（,EB,）为强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。,目前实验室一般用相对安全的,GoldenView,等核酸荧光染料代替。,四、印迹转移电泳,生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的,DNA,进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，,1975,年，,Southern,创造了将,DNA,区带原位转移到硝酸基纤维素膜,(NC,膜,),上，再进行杂交的方法，被称为,Southern,印迹法,。随后，,Alwine,等将类似方法用于,RNA,印迹，被戏称为,Northern,印迹,，,1979,年,Towbin,等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为,Western,印迹,，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。,1982,年,Reinhart,等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上 ，,称,Eastern,印迹,。,目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有,SDS,、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便。,进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，,pH,要远离,pI,，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的,Tris-,缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高。,一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于,20kb,的,DNA,。这是因为在琼脂糖凝胶中，,DNA,分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使,DNA,变形挤过筛孔,，而沿着泳动方向,伸直,，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时,改变电场方向,，则,DNA,分子必须改变其构象，,沿新的泳动方向伸直,，而转向时间与,DNA,分子大小关系极为密切。,五、交变脉冲电场凝胶电泳,1983,年，,Schwartz,等人根据,DNA,分子弹性弛豫时间,(,外推为零的滞留时间,),与,DNA,分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直方向的不均匀电场，使,DNA,分子在凝胶中不断改变方向，从而使,DNA,按分子大小分开。后来，,Carle,等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场,(periodic inversion of the electric field),亦能使大分子,DNA,通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为,N,，正极为,S,；另一组负极为,W,，正极为,E,。,一块正方形琼脂糖凝胶板,(10cm,10cm,或,20cm,20cm),呈,45,置于中央，电场在,N-S,和,W-E,之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的,DNA,分子大小有关。电泳时，,DNA,分子处在连续间隔交替的电场中。首先向,S,极移动，然后改向,E,极。在每次电场方向改变时，,DNA,分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当,DNA,分子达到一定构型后，才能继续前进。,DNA,分子净移动方向与加样线,(,图中点线,),垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万,bp,的大分子,DNA,。较新式的仪器电极间的 角度和脉冲时间均可调，使用更加方便。,按电泳法分： 按超速离心法分：,乳糜微粒（,CM,） 乳糜微粒,CM ( pI,，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；,VLDL,为圆形，受阻力小，,LDL,形态不规则，受阻力大，所以,VLDL,跑在前。,加样槽,前, ,CM LDL VLDL HDL,+,临床应用：高脂蛋白血症的分型,CM ,前, ,正常,型,a,型,b,型,型,型,型,