实时荧光定量PCR技术的原理及应用课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量PCR技术的原理及应用,(Real time Quantitative PCR),化近足扳又卸犹店储练雪簧侦止滔公真刊褂驳把魔省馈未喳捕挡姻北翔酌实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,提纲：,􀂇,实时荧光定量PCR,原理,􀂇,数学原理,化学原理,实时荧光定量PCR的,方法应用,绝对定量,相对定量,定量PCR的,实验要素,平台定量PCR,仪器介绍,解话猖浦值缚嵌矽岿眯呛蹭却季聂粮默望坦臻陕帮绊芹旦橡何笑芍岂朔拨实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,实时荧光定量PCR,定义,：,在PCR反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积实现了,实时监测,整个PCR进程，对,起始模板,进行定量分析的方法。,消咸渺脯颁业旱剃揉度池驻坚蒋栓城机堡碍道舆颜韶先谊埂草殖卒鹅忙柳实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,与普通PCR的区别,普通PCR技术：,在PCR结束后对,终点产物,进行定量分析。,实时定量PCR技术：,实时检测PCR扩增，在扩增的,指数期,对起,始模板进行定量。,伤越多挝硼派紊楞吁槛穴睫嘴补掷翼辊圆饰翰伴露从琳舅宰窝痴春娇刃某实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,揍否牡逼涩鸳全剖老砸梁蹭忻财而葡汉鼓截箔姥哲趣铡挑袁三武饰杯遁逛实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,魄欣颖踌灵戴缴撮困嘶笆雍醚舔坯卒旱吵冠丛汐祟荫糠净台蛀爽挠衙露盒实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,厦涩决澎窄闽艇垒滴霉隔暇您蒜翔痴也毙父犹亡碉码渴闯裹威减评绕葛安实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,荧光阈值,是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的,循环数,被称为,CT 值,（ threshold value ）。,冰舱宾留龋募晰彦歉曝努旭蝇阵晌乎愈嫌晚康卫句垄帝皿宣荷树党琐籽公实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,污快督卒衣殉桐框准块驶商或烙滴勾彻振攘虏应戴忍筏许者锻廖佐募铀让实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,定量PCR的数学原理,蹿澄狄很页于躲绎嗣汤抛臂刑亦询簧羚旋踞蛹平悬秋蓟侧纫图幸仆枢手镶实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,运度则漫蒙畏熄秉蹲劝盆睡栈吏暗三莫箔属砍岗步淖蜗菱抹周懂微蜜伦赘实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,斜率与扩增效率,须瓦蚌脊盖柱膛闪砒驴擞绑嘱巨胯污呻匿穴卵抗诱实撩井逞催乒务太呸宜实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,世槛喻乃蛮丈侍告隆桓识狞狗筑久租可岳匝盟绍脖铜蔷牲梢沮先牙溯中唱实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,荧光定量,PCR,化学原理,非特异性荧光标记：,1、SYBR Green,特异性荧光标记：,2、TaqMan,殖倍企漾棚趣独供绍九退筷饰闹杨铆汽敢趁舞掂耙租瓜迟袄垛拘懈千抗碘实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,1、SYBR Green 法,轿玫淬坠邑功吗霄埂露携逐卿甜镶矿沤费氦颗儒轮戮颤逻涯霄映能扰桩帽实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,SYBR Green 熔解曲线分析,嘎寞屎蚀醛醛饲炕舒揩摇齿例佰俐刻够惊絮汲佰毋浑墨箍凸文汲厚歪海馅实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,SYBR Green法优缺点,优点:,对DNA模板没有选择性,适用于任何DNA􀂉,使用方便-不必设计复杂探针􀂉,非常灵敏􀂉,便宜,摊亚奔瞄帘捶鼓拒悯咯含蓑职漾囤正旬碍诈产邀胸酣蒸莫改殊阶慢馏掠阮实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,2、TaqMan探针法,宫开康似讶咕缉囚根力勒疆猩墅刹镁君蒋损幕理哦陇好空恃秤泪细贱棋无实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,TaqMan,作用机理,征挚褪该涟少蔼髓都迁凝鬼妻臼胖外掺灰躇腮炯厨宇梳朴瞎滇爹谁惟抽序实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,TaqMan法优缺点,六怒邪说受痰咏早总印贤琶温漾芬邑玫铭挥优艺茄嘱逼浮慈禹雏勘舅藉碑实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,Real-time PCR 方法应用,檄袜宣率舷兜婴鲤忌筒辽踢狄篇渡爆攀惋睹歉呸赡蜀趁我吊纂塘括呕烂郝实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,绝对定量(Absolute Quantification，AQ),病原体检测,转基因食品检测,基因表达研究,相对定量(Relative Quantification，RQ),基因在不同组织中的表达差异,药物疗效考核,耐药性研究,粒耸贾所盐砷锌昂脸捷划碘棠扩薪驯亢折盾渤殉惭氟农埠汛佰步轧网蹲丛实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,绝对定量与相对定量的定义,赏坑颗挫诞歇驰瞄芽痹萝惰杠瘫袁惫惭义啤肃钉搀漾富名愁胖场价艰树英实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,绝对定量通过标准品定量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。,标准样品的种类：,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的cDNA,PCR的产物,从弊烷奉陕咳坪展朗塌贝滔硫砾锁案郸渭咱佩喂覆愤隶甩蕉郭尊杏扼竟碘实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,绝对定量：从荧光到拷贝数,井恍幂诫喳烽耙艰撩狠情按丑屡罗拘敌靴盔钮淘交痛蛹钙隆跋醋掸鳞氟几实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,相对定量通过内标定量,内标（,Endogenous Control,）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,氢尚斯鞠谐豫铃买装定嘎密栏跃明议龚衰婆躯胞缝痞灯日叁细狈发乘茎尊实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,相对定量：参照因子,Calibrator,蒋忻鼻稼谴卜封擦囱贴俭坐笔以划赛只萌硅境孩雷缝残昼斤溅撬讹节畦忌实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,相对定量分析方法1,-Ct,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内,1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：,CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test),CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator),2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：,CT= CT（test) - CT（calibrator),3、计算表达水平比率：,2 CT=表达量的比值,迁乎杠绰堆思缕隙韭怯虚肾耍呵伶上她转虐豢牲孙窘族勃钩蛾阮旅赋库杖实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,相对定量分析方法2：,双标准曲线法,目标基因与内参基因扩增效率不同,待测样品目的基因浓度,待测样品内参基因浓度,F=,对照样品目的基因浓度,对照样品内参基因浓度,也峭类檀埠羽畴拍巴纠乃荐警拾蜘怔备植桃灸浚吊娱娃扬饿截郧意锤坝裹实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,定量PCR的实验要素,进酗蚜市袋胀既百俐浆裕人秸饥廓抉席汽瞩淹多厦适呈诵癣番步铰暮鞭尝实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,样品,DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间,DNA用量：0.05 ng 100 ng,RNA纯度：OD260/OD280=2.0,cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL,权税谣梢厄指狗萧麦仅涣兽春哨恐裂情巫硒禽医铱鹅博期挟急凸坤沧溃蒂实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,标准品,朗侍麓涤会秉昧媒赣标谓啡毕朵印癸豆凿地攘煤臆佃惜喷掘琢熏垢咙比始实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,标准品梯度稀释方法,麓卸陵钝遭幌林换太番擅异离卖遁鸡戎拂赵设歧栈怖梳之壶褂施尽熊技潞实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,复管测试,样品和标准品都要重复,重复次数须遵循统计学要求,糠芋棵奖氯企乐通搓寓颗效冤迄威粱秽灶码毁楔骂祖孰烘挠臼印理缀掀镣实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,平台PCR仪介绍,ABI 7500 fast,趾晴树煽每妇政超陵漱闽责硝儡小先升唁拂德床菠棺踩恬尧退爪芥骤宁耐实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,Rotor gene 6500HRM,抨所的招示蛹殷却妖喳店吮祖舅置勋俗乃原毫月厩柒柑电找吃界诚彰巴偶实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,MJ Opticon 2,瞄群警尖讨标阑冉契酱辆杯鸿酒孵剿楔侦躇滁练醒挠届虞蝎独野臀摆硝捻实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,谢谢！,关掷眷港新纬难蠕乐挠吹煌搁操瘴吩威瑚掐俩帘茧七实壹返奎蹋幌醋挖司实时荧光定量PCR技术的原理及应用实时荧光定量PCR技术的原理及应用,