菜花DNA的提取

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,菜花中,DNA,的提取,一,.,实验原理,1,核酸分离提取的原则,1,）应保证核酸一级结构的完整性,2,）排除其他分子的污染,A, 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶,剂和过高浓度的金属离子,B,其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子,的污染应降低到最低程度,排除其他核酸分子的污染（如：提取,DNA,分子,应除去,RNA,；反之亦然）,2.,核酸提取的步骤,1,）破碎细胞（材料不同，方法不同）,匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。,2,） 除杂质，提,DNA,杂质：蛋白，多糖，脂类，,RNA,，,DNase,A.,DNase,的抑制,DNase,需,Mg2+,Ca2+,激活，所以提取时加,0.01M,EDTA,或,EDTA,钠盐。（螯合金属离子）,加去垢剂或变性剂（,SDS,），可使,DNase,变性失活,B.,除,RNA,酶法,：加,RNase,调节,pH,：,RNA,能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而,DNA,对碱较稳定（核酸的理化性质），所以提,DNA,一般要在偏碱的环境中提取，提,RNA,要在偏酸的环境中稳定。,调节盐浓度,(,盐的分步沉淀,),：在浓,NaCl,（,1,2M,）溶液中，,DNA,溶解度大，,RNA,溶解度小；在稀,NaCl,（,0.14M,）中，,DNA,溶解度小，,RNA,溶解度大，因此可利用不同浓度的,NaCl,溶液将,DNA,和,RNA,从样品中分开。,C.,除蛋白,加去垢剂或变性剂,（,SDS,，十二烷基硫酸锂,LDS,，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与,DNA,分开；,用有机溶剂沉淀，除去蛋白,常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚，,8,羟喹咛，间甲酚等,本次实验所用：氯仿：异戊醇,24,：,1,氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。,异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。,D.,除糖，脂类,对于含糖量高，含脂高的样品需要做,加蛋白水解酶,：如提动物组织中的,DNA,，常加蛋白酶,K,二,.,利用盐不同浓度提取,DNA,1.,实验试剂和器材,1,）材料,菜花,2,）实验试剂,5mol/L NaCl,溶液,;,0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na,溶液,;,25% SDS,溶液；,24:1,氯仿异戊醇混合液；乙醇；,3,） 实验器材,研钵,离心管,:10ml,指管,移液管，,高速离心机,水浴锅,三,.,实验步骤,1.,取菜花,4g,，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊状。,2.,分次加入,10ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA,溶液，将糊状物转入 两个,10ml,的离心管中。,6000r/min,离心,10min,，弃去上清。（注：做鸡肝的可再加,7ml/,管,0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA,溶液，将沉淀搅匀后,6000r/min,离心,8min,，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。,3.,向上述沉淀物加入,0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA,溶液,2ml,/,管，,25,SDS,溶液,0.25,ml/,管,搅拌至混匀。置,60,水浴保温,10min,，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。,4.,加入,5mol/L,NaCl,溶液,1ml,/,管，搅拌混匀，加入约一倍体积的氯仿异戊醇混合物（约,4ml,/,管），颠倒混匀,1,2min,。,6000r/min,离心,10min,。,5.,吸出上清至洗净的研钵中，加入,2,倍体积的预冷,95%,乙醇，放置,2-3,分钟，,DNA,沉淀析出，用玻棒慢慢搅动，可将,DNA,丝状物缠在玻棒上。,6.,将沉淀转入,eppendorf,管中,用无水乙醇洗涤一次,自然干燥,4,保存备检测,.,四,.,实验结果分析讨论,写出本次实验中提取,DNA,时每一步操作中所用试剂的目的。,查阅相关资料，写出至少一种其它方法提取,DNA,的原理及步骤,五,.,琼脂糖凝胶法检测,DNA,核酸检测方法,紫外吸收法,有机试剂法,琼脂糖凝胶电泳法,提取完好的,DNA,琼脂糖凝胶电泳图谱,未除去,RNA,的,DNA,琼脂糖凝胶电泳图谱,