蛋白质综合实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质综合实验,1,蛋白质浓度测定介绍,四种古老的经典方法: 定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。,新的测定法: 考马斯亮蓝法（Bradford法）。,还有近来广为应用的蛋白定量方法BCA法。,2,在选择方法时应考虑,实验对测定所要求的灵敏度和精确度；,蛋白质的性质；,溶液中存在的干扰物质；,测定所要花费的时间。,3,紫外吸收法,较为灵敏；,快速；510分钟； 原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在,280nm处的光吸收. 干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 说明：用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用.,4,BCA,（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）法,原理： 在碱性环境下蛋白质与Cu,2+,络合并将Cu,2+,还原成Cu,1+,。两分子的BCA(在BCA反应液中）螯合一个Cu,1+,，形成,紫色,的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性。优点：灵敏度非常高; 较快速40分钟内；,干扰物质：螯合剂；略高浓度的还原剂 说明：抗干扰能力强， 蛋白不可逆的变性,5,蛋白质含量的测定,（Lowry法）,6,实验目的,1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理,2.掌握Folin-酚法（Lowry法）测定蛋白质浓度的操作技术,7,原理,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu,2+,形成,紫红色,络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成,蓝色,物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。,本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,8,操作方法,血清蛋白的测定和标准曲线制作,试管编号 1 2 3 4 5 6 7,标准蛋白 (,mL,) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ,稀释血清(mL) 1.0,0.9NaCl(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 ,碱性铜溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0,混匀后室温放置20 min。,酚试剂(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5,摇匀，30min后以0号试管为空白对照，在650nm处比色 .,9,作图,以OD650为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制一条过原点的标准曲线。,求算标本血清中的蛋白质浓度,查图：利用测定管读数在标准曲线上查出蛋白量（X），最后如下算出标本的蛋白含量：,gX*（100/0.002）*10,-6,以标准管和测定管的吸光数，按下列公式计算：,g（OD,测定,/OD,标准,*标准管蛋白量）*（100/0.002）,10,注意事项,1）加入酚试剂时动作要快并立即摇匀，不应出现混浊,2）标准曲线制备：,至少要有五个点以上。一条理想的标准曲线应该是斜率接近l，且通过原点的直线，其范围应在被测物浓度的一半到二倍之间。吸光度在0.050.8之间。如果待测样品浓度超过标准曲线浓度范围，应将样品稀释再测。,11,临床意义,总蛋白增加：血液浓缩（严重腹泻、呕吐、高热、休克）；合成增多（多发性骨髓瘤G）,总蛋白减少：,血液稀释（补水过多、水钠潴留）,各种原因所至的白蛋白减少，如：,合成不足（肝脏功能下降）,合成原料不足（饥饿、腹泻、消化道肿瘤）,去路增多(肾病综合症、大量胸腹水、烧伤、大出血),消耗过多（糖尿病、甲亢、肿瘤等）,12,层析法,13,实验目的,1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。,2学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。,14,层析基本知识,层析定义,层析法又称色谱法，利用分离物质中不同组份的,某些理化性质,的差异而建立起来的一种分离技术,由,固定相,和,流动相,组成,15,层析分类,根据操作形式不同分类,根据分离机制不同分类,16,凝胶层析,凝胶是一种具有多孔，网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小，形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。,小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；大小分子分开：大分子行程较短,已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。,17,分辨率不高，分离操作较慢。分子量的差异仅表现在流速的差异上，分离时流速必须严格把握。,对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。,凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。,18,常用的,凝胶类型,有:,交联葡聚糖(sephadex),交联琼脂糖(sepharose CL),聚丙烯酰胺凝胶(biogel P),琼脂糖(biogel A),多孔玻璃(bio glass),聚苯乙烯(bio-beads)等。,Spandex G(10-200),（1）数大，交联度小，网孔大 （2）代表持水量，G-25，1g干胶持水2.5ml.,19,操作：,装柱,加样,洗脱,清洗,凝胶回收,做思考题,20,实验结果,一、描述实验现象,二、分析实验现象,21,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离血清蛋白,22,1了解凝胶电泳的基本原理及其主要影响因素。,2掌握凝胶电泳分离血清蛋白的方法。,实验目的,23,实验原理,以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是聚丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为TEMED（四甲基乙二胺,）,。,本实验采用聚丙烯酰胺凝胶不连续体系与非解离体系，电泳迁移率的大小与带电粒子的大小、形状和带净电荷的数量等因素有关。电荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过,浓缩效应,、,电荷效应,、,分子筛效应,而被精细地分离。,由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成57个组分，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分出1230个组分。,24,实验仪器,1垂直板电泳糟,2直流稳压电源,3微量移液器,4脱色摇床,25,实验试剂与材料,1分离胶缓冲液(4X) ： 1.5M Tris一HCl pH8.8，100ml,2浓缩胶缓冲液(4X) ： 0.5M Tris一HCl PH6.7，100ml,3胶母液(T34%，C6%) ：称取丙烯酰胺29.2g， 亚甲双丙烯酰胺0.8g，水溶至100ml，,不能加热。,410%过硫酸铵(AP) ：用少量煮过10分钟并冷却的蒸馏水配制，在4可存3-4周，,100ml。,5电极缓冲液(l0X) ：称Tris l5.lg，甘氨酸72g溶于水中，定容至500ml，使用前1:9稀释,（或者再稀释2-5倍也可）。,6样品染色液（ 考马斯亮兰染色液） ： 0.09%考马斯亮兰R一250，454ml 50%甲醇，,46ml冰乙酸定容到5O0ml。,7加样缓冲液：甘油3.2m1，2M Tris一HCl（pH6.8）1.25ml，溴酚兰粉末少许加水至,l0ml。,8脱色液： 20%甲醇，7%10%的冰乙酸(现用现配),9凝胶配制：实验用分离胶为10%，浓缩胶为3%（现用现配）,26,(一)凝胶的制备,(二)加样,(三)电泳,(四)剥胶,(五)染色,(六)脱色,基本实验步骤,27,实验步骤,1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求对齐，夹好。,将胶模装入电泳槽固定好,，并将胶模下端封好，防漏。(电泳槽按要求清洗干净)。,2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离胶，缓慢注入胶模中（占玻璃板的2/3），为了防止氧化，沿玻璃板壁轻轻加一层水层（注意不能将胶冲起），室温下聚合40min。,28,3. 制备浓缩胶：配制好4%浓缩胶。将胶模中上层水倾倒出去，用滤纸吸干余水。倒入浓缩胶插好样品梳，注意避免汽泡出现，室温下聚合20min。,4.,将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中,，检查是否漏液后，倒入电泳缓冲液，胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板（矮板在内）。,5. 上样：将样品梳拔出，用电极缓冲液冲洗样品孔。样品与样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为1- 2g/l）。,29,电泳,:,连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。,染色,:,关闭电源，取下凝胶模。用剪刀轻轻撬起胶模的,下方一侧，一个玻璃板即可取下，用刀片轻轻将胶的两侧划一下，掀起胶的一角，慢向前推同时注水，靠水流压力和润滑作用，将玻璃板与胶分开。一次不行，可从另一端再操作或两端同时操作，在脱色摇床上用考马斯亮兰染色,2h,。,8,脱色：将胶取出，蒸馏水冲洗数次后，放入脱色液中，,数小时换液一次，直至背景清晰为止（或直接用少许水煮到背景清晰为止）。,30,分离胶和浓缩胶配制,10%分离胶(,l),4%浓缩胶(,l),H,2,O 4200 3050,30.8%Acr/Bis 3250 650,1.5Tris-HCL PH8.8 2500 0.5Tris-HCL PH6.8 1250,10%APS 100 50,TEMED 10 4.5,31,注意事项,1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。,2丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（4）保存。可贮存12个月。测定pH（4.95.2）可检查其是否失效，失效不能聚合。,3TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。,4凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢。,32,实验结果,33,电泳条带,聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白质区带分布图,34,实验报告的内容,实验二：目的要求、原理、操作步骤、结果与计算、注意事项。,实验七：目的要求、原理、操作步骤、结果分析、注意事项、思考题3。,实验十六：目的要求、原理、操作步骤、结果结果、注意事项。,35,