guan-2常用技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,细胞工程实验室设置及基本操作,1,2,3,4,培养的实验条件,实验室,准备间,缓冲间,培养室,5,无菌操作培养制备清洗消毒灭菌处理储藏,6,洗涤间,培养基配制间,消毒间,无菌操作室,培养室,理化分析实验室,细胞学实验室,7,8,1基本实验室,1.1 洗涤间,根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m,2,。设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。,9,1.2 培养基配制间,10,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,13,消毒间,11,紫外灯 ：,紫外线消毒。 主要用于培养室,空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,12,电热干燥箱：,干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃,器皿消毒,13,移液器,14,高速离心机,15,1.4无菌操作室,无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。,16,无菌操作室,17,培养器皿,18,超净台,侧流式（垂直式），外流式（水平层流式）气流方向,原理：将室内空气经粗过滤器初过滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器,精滤，由此送出的洁净气流以一定均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的,高洁净工作环境。,19,为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。 培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm。,1.5 培养室,20,21,22,23,CO2培养箱,CO2,培养箱设定的条件为,37 ,，,5,CO,2,。,使用,CO2,培养箱培养细胞时应注意的问题：,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。,保持培养箱内空气干净。定期消毒,（,90 ,，,14 h),。,箱内灭菌蒸馏水,3000,毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,24,25,26,27,28,29,30,31,32,2 实验基本操作一.洗涤技术(1)洗涤液的配制,33,34,(2)洗涤方法,A、,新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先,浸泡,或用0.5的去污剂洗刷，再用自来水,冲洗,，然后,浸酸,在5HCL中过夜（不可少于4h），再用自来水,冲洗,，最后用无离子水冲洗2次，在100120烘箱内烘干备用。,35,B、,使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。,36,C、 塑料器皿的清洗 自来水充分,浸泡冲洗2NaOH浸泡过夜自来水冲洗25HCl浸泡30min自来水冲洗蒸馏水漂洗3次晾干紫外线照射30min,。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa高压灭菌15min。,37,D、金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E、不锈钢除菌过滤器的清洗 用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。F、胶塞的清洗 新购置的胶塞带有大量滑石粉及杂质，先用自来水冲净，再常规处理，即每次用后立即置入水中浸泡，然后用2NaOH煮沸1020min，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用25HCL浸泡30min，或蒸馏水冲洗后再煮沸20min，晾干备用。,38,39,二.灭菌,（一）对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。,40,（二）、灭菌的方法：,1、,物理方法,：干热、湿热、过滤（0.25um）、紫外线、射线等。,2、化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等,41,（1）干热灭菌,适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150,、40min或120,、120min，如果发现芽孢杆菌，160,、90120min。,42,（2）湿热灭菌,适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121,维持2030min注意点：加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖,43,培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌,灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜，滤膜孔径0.22-0.45um。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50左右时，加入适量的激素，然后分装。,（3）过滤灭菌,44,主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。,（4）紫外线灭菌,45,（6）消毒剂适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。,几种常用消毒剂的效果比较,消 毒 剂,使用浓度(%),消毒时间(min.),效 果,残液去除难易,乙醇,70-75,0.1-3,好,易,新洁尔灭,1020,530,好,易,氯化汞,0.11,215,最好,最难,过氧化氢,1012,515,较好,最易,抗菌素,450mgl,-1,3060,较好,较难,次氯酸钙/钠,9 10,530,好,易,46,人为因素,（工作人员本身）：工作服、帽、口罩等。,物品因素,器皿和用具,培养皿：洗热压,玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干,接种用具：用,CCL,4,布擦湿布擦,泡,75%95%,酒精烧,培养基,：湿热,培养材料,外部细菌：用水冲洗化学药剂处理,内部细菌,茎尖培养,加抗生素：青霉素、利福平,空气,：洗刷地板,95%,酒精擦超净工作台,用化学试剂薰蒸,污染来源,三、无菌操作技术,47,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,48,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,49,50,培养基基本成份,水,大量元素,微量元素,有机成份,激素,其它,51,Medium,52,Medium,53,54,培养基的配制,1、计量,根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，,2、移液,按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于量杯中备用。,注意 （1）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。2）量取母液时，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。,3、混合定容,，来回混合几次。,4、调pH,用滴管吸取NaOH或HCl溶液，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高0.20.5个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5个单位左右)。,5、分装,溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。每1L培养基，可分装2030瓶,6、包扎,用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。,7、培养基的灭菌,55,Solutions used in cell culture,Phosphate Buffered Saline - Ca2+ Mg2+ Free (PBS-CMF),Used to wash/remove excess serum that inhibits the function of TRED. Calcium will also inhibit the function of TRED.Must be warmed in the water bath before use so cells are not shocked by cold liquid.,56,An enzyme used to detach the cells from a culture dish.Trypsin cleaves peptide bonds (LYS or ARG) in fibronectin of the extracellular matrix.EDTA chelates calcium ions in the media that would normally inhibit trypsin.,(2)Trypsin EDTA (TRED),57,Trypsin will self digest and become ineffective if left in water bath more than 20 minutes.Trypsinizing cells too long will reduce cell viability,58,An exclusion dyeLiving cells cannot take up the dye and will appear bright and refractile.Dead cells with broken membranes will absorb the dye and appear blue.,(3) Trypan Blue,59,60,（一）温度,与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为,37,，偏离此温度，细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚至导致死亡。,61,（二）pH,细胞培养的pH最适为,7.27.4,之间，当pH低于6或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。,62,（三）气体,细胞的生长,代谢,自然离不开气体，容器空间中的O,2,及CO,2,足以保证细胞体内代谢活动的进行，但作为代谢产物的CO,2,在培养环境中还有另一个重要作用：即,调节pH,的作用 。,63,Medium,Dissolved gases,to control pH together with NaHCO,3,H,2,O + CO,2,H,2,CO,3,H,+,+ HCO,3,-,Handerson-Hasselbach eqn predicts pH:,pH = 6.0966+log(HCO,3,-,/CO,2,),5-10% ambient,CO,2,dissolves in the medium,decreasing pH,addition of,NaHCO,3,increases,HCO,3,-,thus promotes H,2,C0,3,formation increasing pH,64,Medium,Dissolved gases,What if 5%,10%?,pH drops to 7.2 from 7.4,Oxygen consumption by cells:,delivery is different than,in vivo,diffusion as opposed to hemoglobin transport,limited by,solubility of oxygen in media at 37,C,transport from gas phase to cell surface,dissolution, diffusion and consumption,分解 扩散,65,Medium,Oxygen: pH of the medium at high cell #?,O,2,consumption per unit area increases,O,2,concentration on the cell surface decreases,shift to anaerobic metabolism,无氧,formation of lactic acid and CO,2,be alarmed if phenol red turns to orange!,66,（四）营养,动物细胞的培养对营养的,要求较高,，往往需要多种,氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生长因子,等，其中很多成分由血清、胚胎浸出液等提供，在很多情况下还需加入,10的胎牛或新生牛血清,。,67,四、细胞培养的污染和检测,Contaminants,Bacteria, yeasts, fungi, molds, mycoplasma,支原体,characteristic features:,cloudiness of medium,change in culture appearance (foamy cytoplasm, dark intracellular inclusions,，,observable colonies,),change in pH (medium color changes),decrease,- bacteria,increase,- fungal,Mycoplasms,tend not to destroy cultures but may alter metabolism; they can be detected by fluorescent methods of DNA detection,68,Microbes (cont.),yeast,round,refractile,particles,fungi (molds),thin filamentous extensions,mycoplasma,and virus,difficult to detect visually,can pass through filters,be alert for unexpected behavior in culture (morphology, growth rate etc.),use commercial kits,69,Fungus,70,71,多数污染无法挽救，弃之细胞培养的关键在于无菌操作利用抗生素，加温处理，动物体内接种等处理污染。另外：防止细胞交叉污染,微生物防治,72,实验室的生物安全,世界卫生组织（WHO）一直非常重视生物实验室安全问题，早在1983年就出版了实验室生物安全手册，将传染性微生物根据其致病能力和传染的危险程度等划分为四类；将生物实验室根据其设备和技术条件等划分为四级；其相应的操作程序也划分为四级，并对四类微生物可操作的相应级别的实验室及程序进行了规定。2003年4月实验室生物安全手册（第三版）以电子版的形式在WHO网页上问世。,73,实验室的生物安全,进行细胞或组织培养时，尤其是含有病原的生物材料的培养，不仅要保证培养物不受污染，也要保证培养物不会对实验人员和环境造成污染。,中华人民共和国传染病防治法实施办法第12章第15条规定，凡从事致病性微生物实验的科研、教学和生产单位，作为各类传染病研究操作的基本单元，实验室必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防护措施。,物理性防护由隔离设备、实验室设计及实验实施三方面组成，根据其密封程度，分P1、P2、P3和P4四个生物安全等级。,74,有人把P4实验室叫做“魔鬼实验室”，这个实验室中装有特殊的空调系统，进入这里的空气温度与湿度都是预先设定好的，过滤程度达到99.999，能保障空气在整个环境中1h循环多次。实验室采用定向负压系统，其核心区的压强达到-40Pa，这样实验室空气的流动，只能是通过高效过滤器从外面进来，而保证实验室内的空气不向外流动。,75,无菌操作技术,1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台 面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,76,5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。,6、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。,注意（1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。,（5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。,77,Techniques in Cell Engineering,Preparatory observe,put forward theoretics,Design control tests,Collect data,Explain results,Devise conclusion,Refer to knowledge,78,思考题,1 简述常用的器械清洗步骤和操作要领。,2 分析不同的消毒除菌方法各适用于什么物品和场所。,3 细胞培养常见的污染有哪些？怎样检测和预防？,4 自行设计一个细胞工程实验室方案。,79,谢 谢 大 家,80,