PCR技术7

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,PCR技术,第一节,PCR,技术的基本原理,第二节,PCR,反应体系中的各,种组分分析,第三节,PCR,技术的分类,第四节,PCR,技术的应用,第五节,DNA,分子标记,内容,基因克隆,目的基因的分离和制备,目的基因的体外重组,重组子导入宿主细胞,PCR,Polymerase,chain reaction，,聚合酶链式反应,PCR,的最早设想 ： 1971年，,Korana,最早提出核酸体外扩增的设想：“经过,DNA,变性，与合适的引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因”。,PCR,的实现 ：1983年，美国,PE-,Cetus,公司人类遗传研究室的科学家,K.B.Mullis,等人发明了,PCR，,又称为基因的体外扩增法。,1985年公开报道,PCR,1987年,PCR,得到美国的专利权,1989年,PCR,技术被“,Science”,杂志评为十大科技新闻之一,1993年,Mullis,因发明了,PCR,而获得诺贝尔化学奖,PCR,技术操作简便，可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的,DNA,片段扩增10,9,倍，且无需烦琐的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的,DNA,拷贝。,第一节,PCR,技术的基本原理,一、,PCR,技术的基本原理,二、,PCR,扩增过程,三、,PCR,技术的特点,一、,PCR,技术的基本原理,依据体内,DNA,的半保留复制机理及,DNA,分子在不同温度下双链和单链可以相互转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，使双链,DNA,变成两条单链,DNA，,单链,DNA,用4种,dNTPs,在引物和,DNA,pol,的作用下合成新生的,DNA,互补链。,二、,PCR,扩增过程,变性（,denaturation,）,退火（,annealing）,延伸（,extension）,1、高温变性,在,高温条件下，使,DNA,双螺旋的氢键断裂，双链,DNA,变成单链,DNA,变性温度：,9497，常95 ,3050,s，,常,30,s,变性,引物,2、低温退火,当,温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板,DNA，,使引物于其互补的模板在局部形成杂交链。,退火温度：,2560，常55,6090,s，,常60,s,3、适温延伸,在,DNA,pol,和4种,dNTPs,底物及,Mg,2+,存在的条件下，,pol,催化以引物位起点的,DNA,链的延伸反应,延伸温度：,7074，常72,60120,s,PCR,原理,PCR,扩增过程,PCR,扩增过程,PCR,原理,PCR,的反应动力学,理论上为2,n,。,30,次循环，,DNA,产量达10,9,拷贝,实际上为(1+,R),n,。R,为,扩增效率，平均为75%,30次循环，,DNA,产量实际为10,6,-10,7,拷贝,三、,PCR,技术的特点,高度的敏感性,高度的特异性,操作简便、快速,适用样品的广泛性,高度的敏感性,可将极微量（,pg,级）,DNA,扩增到紫外光下可见的水平（,g,级）,从100万个细胞中检出一个靶细胞；,在细菌学中最小检出率为3个细菌,对单拷贝基因、单根头发、一滴血等微量标本进行分析,高度的特异性,PCR,反应的特异性决定因素为：,引物与模板,DNA,特异正确的结合；,碱基配对原则；,Taq,DNA,聚合酶合成反应的忠实性；,靶基因的特异性与保守性。,高度的特异性,PCR,扩增的特异性依赖于两个引物的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性,只要引物设计合理、反应温度适宜，,PCR,的特异性是相当高的,操作简便快速,PCR,仪,1-2小时或数小时,扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,PCR,仪生产厂家,中国科学院遗传研究所,复旦大学,北京市应用新技术研究所,美国,Perkin,Elmer,公司的,TC1、480、9600,瑞典,Pharmacia,公司的,Gene ATAG,TM,PCR,PCR,仪种类,机械手臂式（转移式）,PCR,变温式（固定式）,PCR,PCR,仪,techgene,英,PCR,仪,SRX-481,高效水冷全自动基因扩增仪,半导体式全自动,PCR,仪,适用样品的广泛性,对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，,DNA,粗制品及,总,RNA,均可作为扩增模板。,可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的,DNA,扩增检测。,可以,DNA,或,RNA，,纯化的或粗制的；新鲜组织或陈旧样品；细胞或体液；完整大分子或部分降解的,DNA,第二节,PCR,反应体系中的各组分分析,一、引物,二、,DNA,pol,三、,DNA,模板,四、,dNTPs,五、,PCR,反应的缓冲液,六、,Mg,2+,七、,PCR,反应条件的选择,八、标准的,PCR,反应体系,一、引物,引物的,设计决定,PCR,反应的成败,PCR,的效率和特异性取决于：,1、引物与模板的特异结合,2、聚合酶对引物的有效延伸,引物设计原则,1、引物长度以16-30为宜,引物过短，特异性降低,引物过长，成本增加，,PCR,的最适延伸温度会超过,Taq,DNA,pol,的最适温度,若引物长8,bp,，,则平均每隔4,8,=65536,bp,就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点,若引物长16,bp,，,则平均每隔4,16,=4.2910,9,bp,有一个结合位点。,引物设计原则,2,、引物扩增跨度： 以200-500,bp,为宜，特定条件下可扩增长至10,kb,的片段,3、引物碱基：,G+C,含量以40-60%为宜,4、,碱基分布的随机性：,ATGC,随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3端，不应有连续3个,G,或,C,5、,避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物设计原则,6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体,7、引物3端是引发延伸的点，不应错配：由于,ATGC,引起错配有一定规律，以引物3端,T,影响最大，因此，3端的末位碱基最好选,ACG，,而不选,T。,8、,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,引物设计原则,9、引物5端可以修饰,加酶切位点；用生物素、荧光物质、地高辛等标记；引入突变位点；引入启动子序列；引入蛋白质结合序列,5端修饰后不影响正常的,PCR,反应,常用引物修饰法,引物修饰法,用途,酶切位点,便于克隆,噬菌体启动子,合成,RNA,探针、测序,蛋白质结合序列,产物纯化、检测,核糖体结合位点,高效表达,同位素,检测、定量,生物素,检测、纯化、定量,荧光素,检测、纯化、定量,酶,检测,返回,引物的保存和使用浓度,冻干，-20，可保存1年，常保存6月,使用最终浓度：0.2-1.0,mol/L，,适宜,小于0.2,mol/L，,影响产量,大于1.0,mol/L，,不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体,二、,DNA,Pol,Mullis,最初使用的,DNA,聚合酶是,E.,coli,DNA,pol,I,的,Klenow,片段,缺点：,1、,Klenow,酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加。,2、引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其,PCR,产物特异性较差，合成的,DNA,片段不均一。,T4 DNA,pol,和,T7 DNA,pol,1988年初，,Keohanog,改用,T4 DNA,pol,进行,PCR，,其扩增的,DNA,片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种,DNA,片段。但每循环一次，仍需加入新酶。,T7 DNA,pol,Taq,DNA,pol,的发现,1976年，,Chein,分离出一种热稳定的聚合酶,1986年，,Erlich,从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离并纯化了,Taq,DNA,pol,，,生长在70-75极富含矿物质的环境中,1988,年，,R.K.Saiki,等成功将,Taq,DNA,pol,应用于,PCR。,用于,PCR,的,pol,种类,水生栖热菌(,Thermus aquaticus,)yT1,株分离提取的,Taq,DNA,pol,。,嗜热,栖热菌（,Thermus thermophilus,）,提取的,Tth,DNA,pol,，,活性是,Taq,DNA,pol,的100倍,栖热球菌（,Thermococcus litoralis,）,中,分离的,VENT,酶，100,时半衰期达95,min,酸热浴硫化裂片菌中分离的,Sac,酶，耐受100,各种耐热,DNA,pol,的特性,Taq,Tth,VENT,Sac,必需金属离子,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,Mg,2+,3,-5外切活性,+,+,5,-3外切活性,+,+,+,+,耐受100,+,+,Taq,DNA,pol,的特点,耐高温。在70下反应2,h,后其残留活性是原来的90%，在93下反应2,h,后其残留活性是原来的60%，在95下反应2,h,后其残留活性是原来的40%。,在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶,大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0,Kb),Taq,DNA,pol,酶活性,75-80,，150,bp,/s,72，100bp/s,70，60bp/s,55，22bp/s,37，1.5bp/S,22，0.25bp/s,离子依赖性,TaqDNA,聚合酶是,Mg,2+,依赖性酶，该酶的催化活性对,Mg,2+,浓度非常敏感,Mg,2+,浓度过低，,Taq,酶活力下降；,Mg,2+,浓度过高，使酶催化非特异性扩增,Taq,DNA,pol,的忠实,性,Taq,DNA,pol,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，因而无效正阅读功能，在扩增中可引起错配,。,Taq,DNA,聚合酶的碱基错配机率为2.110,-4,.,降低,Mg,2+,浓度（1.5,mmol,/L），,降低,dNTPs,浓度（20,mol/L），,提高退火温度（大于55），缩短延伸时间（60,s）,可提高,Taq,DNA,pol,的忠实性，此时的平均错配率为5 10,-6,.,Taq,DNA,pol,的抑制剂,低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(,DMF),和二甲基亚砜(,DMSD),对,Taq,DNA,pol,的催化活性并无影响.,极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0.06%)，十二烷基肌氨酸钠(小于0.02%)，,SDS(,小于0.01%)几乎可完全抑制该酶的活性.,非离子表面活性剂在较高浓度(,Tween20，NP-40,和,Tritox,-100),如5%时方能 抑制该酶的活性.,Taq,DNA,pol,的灭活,100加热10,min,以上,加入10,mmol,/L EDTA，,使其结合,Mg,2+,Taq,DNA,pol,的,使用浓度和生产厂家,每,100,l,反应液中含2.5,l,Taq,DNA,pol,为宜,Taq,DNA,pol,应于-20保存,复旦大学、中科院遗传所、军事医学科学院、上海华美公司,不同厂家酶的定位及生产条件不同，可根据具体情况区别使用,三、,DNA,模板,模板的来源,培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本、血液、毛发、尿液、犯罪现场,DNA,或,RNA，RNA,作模板时要反转录成,cDNA,DNA,模板的用量,理论上10,2,-10,4,拷贝的模板可满足各种要求的,PCR,反应,E.,coli,DNA0.1ng310,4,拷贝,人染色体,DNA0.1,g310,4,拷贝,酵母,DNA1ng 310,4,拷贝,DNA,模板的纯度,DNA,样品尽量要纯，尤其不能有核酸酶及蛋白酶等,大多,PCR，,对,DNA,模板的要求不严格，存在一定量的蛋白质、,SDS,等对实验影响不大,没有交叉污染,DNA,模板的制备,传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如,SDS,等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶,K,来消化去除蛋白质，尤其是与,DNA,结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供,PCR,实验用,DNA,模板的制备,SDS,溶解细胞膜上的脂类与,Pr，,溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，,SDS,与,Pr,结合而沉淀；,蛋白酶,K,水解消化,Pr，,特别是与,DNA,结合的组蛋白，再用酚与氯仿抽提,Pr,和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于,PCR,反应。,一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的,Pr,使靶基因游离，直接用于,PCR,扩增。,RNA,模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶,K,法，要防止,RNase,降解,RNA。,四、,dNTPS,dATP,、,dTTP,、,dGTP,、,dCTP,.,dNTP,粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性,dNTP,溶液呈酸性，使用时应用,1,M,NaOH,将其,PH,调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使,dNTP,降解,dNTP,的浓度,PCR,常用的,dNTP,浓度为50200,umol,/L,4,种,dNTP,的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。,dNTP,浓度过低会使反应速度下降，降低,PCR,产物的产量，但可提高实验的精确性。,dNTP,浓度过高，可加快反应速度，但也增加碱基的错配率和实验成本,dNTP,能与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度降低。,五、,PCR,反应的缓冲液,PCR,中常使用10-50,mmol,/L,Tris,-,HCl,（pH8.3-8.8）,缓冲液,作用：调节,pH,值，使,Taq,DNA,pol,作用环境维持偏碱性,缓冲液配方,10-50,mmol/L,Tris,-,HCl,，,50mmol/L,KCl,，,有利于引物退火，大于此浓度会抑制,Taq,DNA,pol,的活性,100,g/L BSA（,小牛血清），保护酶,0.05-0.1%,Tween,-20，,保护酶,5,mmol,/L DTT（,二硫苏糖醇），保护酶,10%,DMSO（,二甲基亚砜），减少模板二级结构，提高反应特异性,5%甲酰胺或,5%,氯化四甲基胺（,TMAC），,提高反应特异性，对酶活性无明显影响,六、,Mg,2+,浓度,PCR,反应体系中，,dNTPs,、,引物、,DNA,模板等中的磷酸基团均可与,Mg,2+,结合而降低,Mg,2+,浓度,Mg,2+,浓度要比,dNTP,的浓度高0.2-2.5,mmol,/L,在一般的,PCR,反应中，各种,dNTP,浓度为200,umol,/L,时，,Mg,2+,浓度为1.52.0,mmol,/L,为宜。,七、,PCR,反应条件的选择,变性温度和时间,退火温度和时间,延伸温度和时间,循环次数,变性温度与时间,DNA,中,GC,含量越高，要求的变性温度越高,通常为9530,s，,或9394,lmin,第一次反应时反应管达到所需温度需要一段时间，因此要适当延长时间。最好为95，4-6,min，,在以后的循环中，变性步骤设为9530,s,为,防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管中加入液体石蜡,退火温度与时间,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。,对于20个,bp,，G+C,含量约50%的引物，55为最适退火温度较为理想。,公式帮助选择合适的温度：,Tm=4(G+C)2(A+T),复性温度=,Tm(510),在,Tm,值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高,PCR,反应的特异性。,复性时间一般为3060,sec，,足以使引物与模板之间完全结合。,延伸温度与时间,PCR,反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合,PCR,延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1,Kb,以内的,DNA,片段，延伸时间1,min,是足够的。34,kb,的靶序列需34,min；,扩增10,Kb,需延伸至15,min。,延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,延伸终止,最后一个反应循环结束后，应使,PCR,反应在72进一步延伸5,min，,以提高产物的扩增率，然后将反应混合液冷却至4，或加入,EDTA,到10,mmol,/L,终止反应,循环次数,循环次数决定,PCR,扩增程度。,PCR,循环次数主要取决于模板,DNA,的浓度。,一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,八、标准的,PCR,反应体系,10扩增缓冲液 10,ul,4,种,dNTP,混合物 各200,umol,/L,2,个引物 各10100,pmol,模板,DNA 0.12ug,Taq,DNA,聚合酶 2.5,u,Mg,2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水至 100,ul,九、,PCR,扩增产物的分析,凝胶电泳分析,酶切分析,分子杂交,核酸序列分析,凝胶电泳分析,PCR,产物电泳，,EB,染色紫外分析仪下观察，初步判断产物的特异性。,PCR,产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重,PCR，,应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。,琼脂糖凝胶电泳： 通常用12%的琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析,凝胶电泳分析,PCR,扩增,P53,基因,酶切分析,根据,PCR,产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。,PCR,产物的酶切,分子杂交,分子杂交是检测,PCR,产物特异性的有力证据，也是检测,PCR,产物碱基突变的有效方法。,Southern blotting：,在两引物之间另合成一条寡核苷酸链标记后做探针，与,PCR,产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测,PCR,产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。,斑点杂交：将,PCR,产物点在,NC,膜或尼膜膜上，再与内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于,PCR,产物特异性鉴定及变异分析。,核酸序列分析,是检测,PCR,产物特异性的最可靠方法。,十、常见问题分析与对策,假阴性，不出现扩增条带,假阳性,出现非特异性扩增带,出现片状拖带或涂抹带,PCR,污染与对策,假阴性，不出现扩增条带,PCR,反应的关键环节：,模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量,PCR,循环条件,假阴性的原因模板,模板中含有杂蛋白质,模板中含有,Taq,酶抑制剂,模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚,模板核酸变性不彻底,假阴性的原因酶失活,酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。,需注意的是有时忘加,Taq,酶或溴乙锭,假阴性的原因引物,引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是,PCR,失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。,选定一个好的引物合成单位,引物的浓度不仅要看,OD,值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致,引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效,引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。,假阴性的原因,Mg,2+,浓度,Mg,2+,浓度对,PCR,扩增效率影响很大,浓度过高可降低,PCR,扩增的特异性,浓度过低则影响,PCR,扩增产量甚至使,PCR,扩增失败而不出扩增条带。,假阴性的原因反应体积的改变,通常进行,PCR,扩增采用的体积为20,ul,、30ul、50ul,或100,ul,，,应用多大体积进行,PCR,扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20,ul,后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。,假阴性的原因物理原因,变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性,退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低,PCR,扩增效率,用标准的温度计检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是,PCR,失败的原因之一,假阴性的原因靶序列变异,靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合,靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其,PCR,扩增是不会成功的,假阳性,所有样品均为阳性,引物设计不合适,靶序列或扩增产物的交叉污染,假,阳性的原因引物设计不合适,选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行,PCR,扩增时，扩增出的,PCR,产物为非目的性的序列,靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性,需重新设计引物,假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染,1、整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：,操作时应小心轻放，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外,除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用,必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,假阳性的原因靶序列或扩增产物的交叉污染,2、空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。与引物互补后，可扩增出,PCR,产物，而导致假阳性的产生,出现非特异性扩增带,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,出现非特异性扩增带的原因,引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体,Mg,2+,离子浓度过高、退火温度过低，及,PCR,循环次数过多有关,酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。,出现非特异性扩增带采取的对策,必要时重新设计引物,减低酶量或调换另一来源的酶,降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数,适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。,出现片状拖带或涂抹带,PCR,扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带,出现片状拖带的原因,酶量过多或酶的质量差,dNTP,浓度过高,Mg,2+,浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,出现片状拖带的对策,减少酶量，或调换另一来源的酶,减少,dNTP,的浓度,适当降低,Mg,2+,浓度,增加模板量,减少循环次数。,污染原因,1、标本间交叉污染,标本污染主要有收集标本的容器被污染,标本放置时，由于密封不严溢于容器外,容器外粘有标本而造成相互间交叉污染,标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染,有些微生物标本尤其是病毒可随气体扩散，导致彼此间的污染.,污染原因,2、,PCR,试剂的污染,主要是由于在,PCR,试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被,PCR,核酸模板污染.,污染原因,3、,PCR,扩增产物污染，这是,PCR,反应中最主要最常见的污染问题,因为,PCR,产物拷贝量大(一般为10,13,拷贝/,ml)，,远远高于,PCR,检测数个拷贝的极限，所以极微量的,PCR,产物污染，就可形成假阳性,还有一种容易忽视，最可能造成,PCR,产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题,污染原因,4、实验室中克隆质粒的污染,在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大,污染的监测,一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.,阳性对照,阴性对照,重复性试验,选择不同区域的引物进行,PCR,扩增,阳性对照,在建立,PCR,反应实验室及一般的检验单位都应设有,PCR,阳性对照，它是,PCR,反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等，重复性好，经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一,PCR,试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照.,阴性对照,每次,PCR,实验务必做阴性对照,标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.,试剂对照:在,PCR,试剂中不加模板,DNA,或,RNA，,进行,PCR,扩增，以监测试剂是否污染.,防止污染的方法,合理分隔实验室:将样品的处理、配制、,PCR,反应液、,PCR,循环扩增及,PCR,产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及,PCR,产物的鉴定应与其它步骤严格分开.,最好能划分标本处理区；,PCR,反应液制备区；,PCR,循环扩增区；,PCR,产物鉴定区。,实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的,DNA,或,RNA,防止污染的方法,吸样枪：吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染,防止污染的方法,预混和分装,PCR,试剂：所有的,PCR,试剂都应小量分装，如有可能，,PCR,反应液应预先配制好，然后小量分装，-20保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.,PCR,试剂，,PCR,反应液应与样品及,PCR,产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱,防止污染的方法,防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用.,设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照,防止污染的方法,减少,PCR,循环次数，只要,PCR,产物达到检测水平就适可而止.,选择质量好的,Eppendorf,管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出.,第三节,PCR,技术的分类,正常,PCR,巢式,PCR,复合,PCR,不,对称,PCR,反,转录,PCR,反向,PCR,锚定PCR,原位,PCR,免疫,PCR,彩色,PCR,修饰引物,PCR,固着,PCR,膜结合,PCR,重组,PCR,正常,PCR（Normal PCR）,一般的,DNA,模板采用一对引物，经30轮左右循环扩增，即可达到预期的目的,常用于多拷贝,DNA,分子的扩增,PCR,产物的检测：,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,返回,巢式,PCR（Nested PCR）,先用一对引物对模板进行扩增，取出第一次,PCR,产物，然后再用另一对引物扩增第一次,PCR,产物,第一次,PCR,第二次,PCR,外,引物（,outer-primer）,内引物（,inter-primer）,分类,半,巢式,PCR,中途进退式,PCR,半巢式,PCR,Semi-nested PCR,只有一个外引物对模板进行扩增，取出第一次,PCR,产物，然后用另一对内引物扩增,PCR,产物,中途进退式,PCR,Drop-in Drop-out PCR,外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，同时在第一次,PCR,时采用较高的退火温度，而第二次,PCR,采用较低的退火温度，这样在第一次,PCR,时，由于较高的退火温度内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物。经过若干循环,待外引物基本消耗完毕后,无须取出第一次,PCR,产物,只需降低退火温度,即可直接进行第二次,PCR,扩增.,巢式,PCR,的,应用,用于极少量模板的扩增,复合,PCR,Multiplex PCR，,多重引物,PCR，,多重,PCR,在同一,PCR,反应中，用多组引物同时扩增几个基因片段的技术,复合,PCR,产物的电泳图谱,1,2,3,4,marker,复合,PCR,的应用,1、多种病原微生物的同时检测或鉴定,肝炎病毒的感染：甲乙丙型肝炎病毒,肠道致病性细菌的检测：伤寒，痢疾和霍乱,性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.,战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检,需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.,复合,PCR,的应用,2、病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定,乙型肝炎病毒的分型,乳头瘤病毒的分型,单纯疱疹病毒的分型,杜氏肌营养不良症的分型,癌基因的检测等,复合,PCR,的应用,3、多点突变性分子病的诊断,与疾病相关的基因十分庞大，如,Rb,（,视网膜母细胞瘤）基因有数百个,kb，,而,DMD（,进行性肌营养不良症）有2000,kb。,基因上有多处位点发生缺失或突变。,采用复合,PCR,可在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就会消失,多重,PCR,的特点,高效性，在同一,PCR,反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体,系统性，多重,PCR,很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.,经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.,不,对称,PCR,asymmetric PCR,用不等量的一对引物，,PCR,扩增后产生大量的单链,DNA(SSDNA) 。,这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.,0.5,pmol,，,限制引物,25-50,pmol,，,非限制引物,双链,单链,在,PCR,反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链,DNA，,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的,PCR,就会产生大量的单链,DNA.,不对称,PCR,的应用,不对称,PCR,制备的,ssDNA,，,主要用于核酸序列测定.,用于探针的制备,反转录,PCR,reverse transcription PCR，RT-PCR，RNA-PCR,以,mRNA,为模板，在逆转录酶的作用下合成出,cDNA,第一链；,cDNA,以自身为模板合成出互补第二链,反转录酶,mRNA,cDNA,第一链,合成,变性退火,延伸,cDNA,RT-PCR,RT-PCR,RT-PCR,操作步骤,RT-PCR,的应用,克隆,cDNA,。,检测,RNA,合成,cDNA,探针,用寡聚胸腺嘧啶（,polyT,）,和另一随机引物配对，可以制备基因表达文库,常用的反转录酶,RT-PCR,的关键步骤是,RNA,反转录,用作模板的,RNA,可以是总,RNA，,但,不能混有,DNA、Pr,等，尤其不能混有,RNA,酶，因此要严格进行,RNA,纯化,AMV：,鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶,MML：,莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶,反向,PCR,reverse PCR,常规,PCR,只能扩增两端序列已知的目的基因，即两引物之间,DNA,片段。,反向,PCR,是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,原理,选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对靶,DNA,两端序列进行酶切，最好使所产生的带有靶,DNA,的区段不大于2-3,kb。,用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接,用一对反向引物（,outwardly-facing primers）,进行,PCR，,其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.,酶切位点,酶切,引物1,引物2,连接,PCR,反向,PCR,的应用,对,染色体,DNA,进行染色体步查（,Chromosome Walking）,但能被反向,PCR,扩增的,DNA,长度是有限的，因此它只能沿着染色体分子作较短的步移,用于对未知序列的测序,锚定PCR,Anchored PCR，A-PCR,用酶法在反转录的,cDNA3,端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该,cDNA,进行,PCR,扩增的技术,GGGG,GGGG,CCCC,GGGG,CCCC,mRNA,cDNA,逆转录酶,末端转移酶,引物,PCR,锚定引物,特定引物,锚定,PCR,的应用,构建低丰度的,cDNA,文库,分离与一段已知序列相邻的未知序列,扩增特定的,cDNA,片段可用于制备探针,修饰引物,PCR,Modified primer PCR,PCR,引物在合成过程中对5端进行修饰，不但不影响扩增反应的进行，而且方便了产物的分析,还可将一些信号分子，如荧光素、生物素等连接到引物的5末端,引物修饰类型,彩色,PCR,Color PCR,着色互补,PCR，color complementation PCR,荧光,PCR，,fluroscent,PCR,用不同颜色的荧光染料标记引物的5端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况,荧光染料,绿色荧光：,JOE、FAM,红色荧光：,TAMRA、ROX,蓝色荧光：,COUM,荧光的产生,JOE：520nm,激发，产生545,nm,绿色荧光,FAM：438nm,激发，产生520,nm,绿色荧光,TAMRA：,545nm,激发，产生580,nm,红色荧光,ROX：585nm,激发，产生650,nm,红色荧光,COUM：350nm,激发，产生450,nm,蓝色荧光,彩色,PCR,的应用,检测基因的突变、基因缺失,染色体重排或转位,微生物的型别鉴定,为核酸序列测定自动化创造了条件,免疫,PCR,immuno,-PCR,利用抗原-抗体反应的特异性和,PCR,扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测,免疫,PCR,的步骤,抗原-抗体反应,与嵌合连接分子结合,PCR,扩增嵌合连接分子中的,DNA（,一般为质粒,DNA）.,该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备,嵌合连接分子有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒,DNA,结合，形成抗原抗体-连接分子-,DNA,复合物，通过,PCR,扩增,DNA,来判断是否存在特异性抗原.,链,亲和素-蛋白,A,嵌合分子,免疫-,PCR,优点,特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.,敏感度高，,PCR,具有惊人的扩增能力，免疫,PCR,比,ELISA,敏感度高10,5,倍以上，可用于单个抗原的检测.,操作简便，,PCR,扩增质粒,DNA,比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.,原位,PCR,In,situ,PCR，,涂片,PCR，slide PCR,1990,年，,Hasse,等建立,原位,PCR,就是在组织细胞里进行,PCR,反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的,PCR,技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术,原位,PCR,方法,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.,固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶,蛋白酶,K,消化处理：用60,ug,/ml,的蛋白酶,K,将固定好的组织细胞片55消化处理2,h,后，962,min,以灭活蛋白酶,K,原位,PCR,方法,PCR,扩增：在组织细胞片上，加,PCR,反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行,PCR,循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位,PCR,的装置.,杂交：,PCR,扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.,显微镜观察结果.,原位,PCR,的,优点,原位,PCR,既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置,特异性和敏感性高于一般的,PCR,和原位杂交.,用于基因重排和突变的检测与分析，如检测病毒感染的细胞，或异常的基因,神经细胞含脂类较高，通透性差，目前尚不适用于原位,PCR,重组,PCR,recombinant PCR,使两个不相邻的,DNA,片段重组在一起的,PCR,Mullis,等于1986年报道了由,PCR,扩增的两个,DNA,片段通过重组合后再经延伸而制备出新的,DNA,分子,PCR,PCR,变性退火,延伸,重组,DNA,第四节,PCR,技术的应用,一、,PCR,在分子生物学中的应用,二、,PCR,在临床医学中的应用,三、,PCE,在法医学中的应用,一、,PCR,在分子生物学中的应用,DNA clone,引入点突变、缺失或插入,重组,PCR,DNA,序列的测定,DNA clone,连接转化,PCR,酶切,载体,酶切,重组质粒,引入点突变、缺失或插入,模板：,A,C,CGT,引物：,T,C,GCA,模板：,ACCGT,引物：,TGG,A,CA,模板：,ACCGT,引物：,TC,CA,重组,PCR,见前面,用于基因工程研究,DNA,序列的测定,化学法和双脱氧法,双链直接测序,双链克隆后测序,基因扩增转录测序,不对称,PCR,产生单链测序,二、,PCR,在临床医学中的应用,遗传性疾病的基因诊断,PCR,技术在检测病毒性疾病中的应用,PCR,技术在检测癌基因中的应用,遗传性疾病的基因诊断,目前有遗传病4000多种,利用已知的基因结构合成一对引物是,PCR,诊断遗传病的最基本条件，也就是说，遗传病的基因结构必须部分或全部清楚.,地中海贫血病的病因,地中海贫血是由珠蛋白链合成不平衡所导致的一类遗传性疾病。,基因缺失,插入或置换造成基因的不表达或表达水平低下,RNA,加工、成熟、翻译异常或,mRNA,无功能或合成不稳定的珠蛋白,-,地中海贫血和,-,地中海贫血,和,珠蛋白基因的突变类型,基因的突变：以缺失型突变最为常见，其缺失的范围可从两个,基因均缺失至一些小片段的缺失，,基因的另一突变即为单碱基置换，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无义突变、剪接部位突变及起始信号突变.,基因的突变：以点突变为主，即单核苷酸置换是,-,基因的主要突变类型，亦有碱基的括入和缺失，,传统的产前诊断方法,取,胎儿脐带血、绒毛等为样品，通过,DNA,分析进行诊断或取胎儿血在体外培养后用,PAGE,测定各珠蛋白链的合成速率比,标本用量大，部分样品只能在胎儿中期取样，分析操作耗时、成本高,PCR,产前诊断胎儿标本的来源,羊水穿刺，在15周后可经母亲腹壁穿刺获羊水，其内含大量胎儿细胞，5-10,ml,羊水即可获得足够量的,PCR,分析,DNA,样品.,绒毛采样，在早期(9-12周)经阴道在,B,超引导采取绒毛样品，它含有丰富的,DNA.,胎儿血液采集：胎儿脐静脉穿刺,胎儿活检：17-19周进行穿刺取样，亦可经胎儿镜取样,母外周血分离胎儿细胞，目前已用于胎儿性别的预测.,宫颈刷取细胞.,着床前取细胞,基因全部缺失的,PCR,诊断,基因全部缺失所引起的临床表现为,Hb,Barts,胎儿水肿综合征,PC01：5TACTGTAGATACCCGTGTACAA3,PC02：5ATCARGGAAACATAGTAAT3,PC03：5ACACAACTGTGTTACCTAGC3,PC04：5CAACTTCATCCACGTTCACC3,扩增片段：, PC01-PC02；136；, PC03-PC04；110；,扩增条件：93(30)；45(30)；65,基因全部缺失的,PCR,诊断,PC03-PC04,扩增产物位于,链,上，作为内对照,结果判定：在正常人,PCO1-PCO2,扩增片段为,136,bp，PCO3-PCO4,为110,bp,，,而,Hb,Barts,胎儿水肿综合征仅有,PC03-PCO4,的110,bp,扩增片段，而无,PCO1,和,PCO2,的136,bp,扩增产物,PCR,诊断,正常内对照,Barts,水肿,PCR,故障,CK,110,136,PCR,技术在,地贫基因诊断中的应用,地贫的基因突变主要是单碱置换。,目前在世界范围内发现的单碱基置换达160余种，其中在中国发现的有21种,珠蛋白基因的突变主要为单碱基碱置换，因此诊断途径与,地贫完全不同，其诊断的主要目的即检出点突变.,PCR-,寡核苷酸探针斑点杂交(,PCR-ASO),如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突变,利用人工合成的寡核苷酸片段（一般为19,bp,）,作为探针，与经,PCR,扩增获得的靶,DNA,进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂来检测,PCR,产物中有无相应突变，即探针与靶,DNA,片段之间只要有一个碱基不相互配对或错记，就能检出,PCR-,寡核苷酸探针斑点杂交,探针：一般合成两个，一个为正常序列，另一个含有突变位点，前者与正常靶,DNA,完全互补，后者只与突变,DNA,互补。该探针称为等位特异寡核苷酸探针(,allele specific,oligo,nucleotide probe，ASO,探针).,点膜与杂交,放射自显影,PCR-ASO,检测结果,1,2,3,4,a b c,A,B,C,A：,样品在膜上的位置，2,C,为正常人，1,C,为突变对照,B：,样品与正常序列寡核苷酸探针杂交，4,a,含突变位点,C：,样品与点突变探针杂交，1,b、4a、4b,含突变位点,因此，4,a,为突变纯合子，1,b、4b,为突变杂合子,PCR,技术在检测病毒性疾病中的应用,人类免疫缺陷病毒(,HIV),乙肝病毒,巨细胞病毒,肠道病毒,肺炎支原体,HIV,的基因结构,RNA,双分子，其单链,RNA,分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因,1、逆转录病毒共同的基因，即,gag、,pol,和,env,基因，及侧翼的长末端重复顺序(,LTR),等。其中前三者为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的,LTRs,，,不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性,2、调节基因表达的基因，即,tat、rev,和,nef,基因，可以增强或抑制其它基因的表达.,HIV,的基因结构,3、特有基因，负调控病毒的感染性、成熟或释放，即,vif,、,vpu,和,vpr,是一个多态性病毒，从不同的,AIDS,患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异,因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有,HIV,的变异性。,目前已知,HIV,有两个型，,HIV-1,是从欧洲和美洲分离毒株的总称，亚洲地区的流行株也基本上为,HIV-1，HIV-2,是从西非的妓女分离的毒株.,HIV,的,PCR,检测,模板的选择和提取：艾滋病患者和,HIV,感染者的血液和各种体液中均含有一定量的病毒。目前作为诊断和研究的标本多采用外周血，因为,HIV,是一种嗜,T,细胞性病毒，其中模板量丰富且易保存。,另外血浆中存在的游离病毒也可以作为提供模板的原料.,HIV,的,PCR,检测,选择合适的引物，改良条件提高敏感性,减少设计引物的序列与,HIV,相关病毒或人细胞,DNA,的同源性,选择的引物要尽量处于,HIV,基因组的高度保守区，如,gag、,env,、,pol,、tat,基因中的某些核苷酸序列,尽量保证引物3端的碱基与模板的匹配，引物内无一级结构和重复性，引物间和引物内不能有互补序列.,由于,HIV,的高度变异，一对引物的扩增结果不够确切，至少需要两对引物扩增才能鉴别阳性反应的存在。多对引物的应用可明显提高,PCR,的敏感性,HIV,的,PCR,检测,PCR,术在,HIV,感染研究中的应用已获良好效果，在目前亚洲地区,HIV,感染增长速率十分迅猛的情况下，开展此项技术的研究对于我国艾滋病的防治有着十分重要的现实意义,PCR,技术在检测癌基因中的应用,ras,基因：大鼠肉瘤,rat sarcoma，1964,年,H-,ras,、K-,ras,、N-,ras,基因在12、13、61发生点突变使,ras,基因活化，产生,ras,癌基因。,PCR,结合寡核苷酸探针杂交检测,P53,基因膀胱癌,三、,PCR,在法医学上的应用,个人识别,亲子鉴定,一、,RFLP,标记,二、,RAPD,标记,三、,AFLP,标记,第五节,DNA,分子标记,一、,RFLP,标记,Restriction fragment length polymorphism,1980,年，,Bostein,首先提出设想,1987年，,Donis,-Keller,等建成了第一张人的,RFLP,图谱,目前，水稻、小麦、番茄等作物均有相当详细的,RFLP,图谱,DNA,物理图谱的构建,RFLP,作图原理,RFLP,的应用,分子水平上的植物分类研究,研究基因突变,研究进化、亲缘关系,RFLP,检测酶切位点的出现或消失,亲子鉴定,二、,RAPD,标记,Random amplified,polymorphic,DNA,1990,年，美国杜邦公司,Williams,在,PCR,基础上发展了,RAPD,技术,基本原理：以一个10,bp,的随机排列的引物在未知序列的基因组,DNA,上进行随机的,PCR,扩增。扩增产物用,PAGE,分离来检测扩增,DN