醋酸纤维薄膜电泳

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验五,醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质,1,一、目的,掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和,方法,二、原理,血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于,pH7.,0,在,pH 8.6,的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，在电场中向正极移动,各种蛋白质的等电点不同，在同一,pH,值下所带电荷量不同,分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不同，这样可将各种血清蛋白质分离,开,2,三、,实验材料及设备,1、样品：新鲜牛血清,（无溶血）,2、仪器：DYY-,2型常压电泳,仪,、卧式电泳,槽,3、器材：,醋酸纤维薄膜,(8,2cm),；,点样器；,培养皿；,滤纸；,直尺、,铅笔；镊子；剪刀；,和铅笔,4、试剂：pH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液,漂洗液,染色液,3,四、操作步骤,1、膜的润湿和选择,迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡30min,选择,薄膜颜色一致而无白色斑点的,膜,2、制作电桥,将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，,使两槽缓冲液平衡至同一水平面,于两电极槽各放入,2,层纱布，一端浸人缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架,当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的纱布以驱赶气泡,4,四、操作步骤,3、点样,点样模板的制,作,取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的缓冲液，,无光面朝上,放在点样模板上,在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地印在点样区,内,4,、电泳,将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上，另一端平贴在阳极端支架,上,连接好电泳仪，,接通电源，调节电压为,100V,，电流为,0.6 mA2n,，电泳,60min,5,四、操作步骤,5、染色与漂洗脱色,染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10min,漂洗脱色:将膜条从染色液中取出后，移置到漂洗液中，,反复漂洗数次，直至背景漂净为止,，,可得到色带清晰的电泳图,谱,五、,记录和分析实验结果,把电泳图谱画在实验报告上,并指出每条区带的种类,6,六、注意事项,1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一,2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸,去，吸水量以不干不湿为宜,3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免,损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果,4、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量,5、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面,向下,6、控制染色时间,7、过程为防止指纹污染，应戴手套,7,七、,思考题,1、,电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？,2、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？,为什么？,尿中17-羟皮质类固醇的测定,8,9,相关知识,1、电泳,带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，EP ),电泳,是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术,2、基本原理,电荷的来源,：,由于本身的解离作用或表面上吸附其它带电质点，在电场中会向一定电极移动,迁移率,：,带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度,其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的数量、颗粒的大小和形状有关,10,10,3、影响电泳迁移率的因素,电场强度,溶液,pH,溶液的离子强度,温度,电渗,支持物,11,电泳的分类,按原理分,区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲液体系分离成独立的区带,移界电泳：是在,U,型管中进行的电泳,等速电泳：,当电泳达到平衡后，各区带相随分出清晰的界面，并以等速移动,等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成,pH,梯度，使被分离物移动到各自等电点的,pH,处聚集成很窄的区带,12,电泳的分类,按有无支持物分,自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术,区带电泳：有支持物的电泳,纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳,圆盘电由泳、平板,(,垂直、水平,),电泳、柱电泳,13,什么是醋酸纤维素薄膜,醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成,厚度约以,0.1-0.15mm,什么是醋酸纤维素薄膜电泳,以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳,14,醋酸纤维素薄膜电泳的特点,吸附作用小，分离效果好,快速省时,灵敏度高，样品用量少,应用面广,易保存，易定,量,15,16,产品名称：双稳定时电泳,仪,产品型号：DYY-6C型,5-600V 4-400mA 240W,17,卧式电泳,槽,18,醋酸纤维薄膜电泳装置示意,图,1、,滤纸桥； 2、电泳槽； 3、醋酸纤维素薄膜；,4、电泳槽膜支架； 5、电极室中央隔板,19,醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意,图,（虚线处为点样位置）,20,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意,图,1、清蛋白，2、1球蛋白 3、2球蛋白,4、球蛋白 5、球蛋白 6、为点样原点,21,22,23,24,25,点样模板的制,作,1.5cm,26,27,优点,微量,快速,简便,分离清晰,对样品无吸附现象,应用,广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋,白、酶的分离和免疫电泳等方,面,28,血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质,量,蛋白质名称,等电点（,pI,）,相对分子质量/,Mr,白蛋白,1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白,-球蛋白,4.88,5.06,5.06,5.12,6.85-7.30,69 000,200 000,300 000,90 000-150 000,156 000-300 000,29,30,31,