的分离、培养和人工重建

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 地衣共生菌藻的分离、培养和人工重建,1,地衣是否能分为单个生物,不同有机组织的相互关系,更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题,次生代谢物的研究,2,一、共生真菌的分离和培养,1、地衣型真菌常用的培养基,2、子囊孢子释放法,3、组织培养法,4,、培养共生菌的保存,3,1,、地衣型真菌常用的培养基,WA4,培养基,含,4%,蒸馏水的琼脂培养基,琼脂,4g,蒸馏水补足,100ml,MY,培养基,麦芽酵母提取物培养基,麦芽提取物,20g /,酵母提取物,2g /,琼脂,20g /,蒸馏水补足,1000ml,LB,培养基,Lilly and Barnett s,培养基,葡萄糖,10g /,天冬酰胺酸,2g / KH,2,PO,4,1g / MgSO,4,7H,2,O 0.5g / Fe(NO,3,)39H,2,O 0.2 mg / ZnSO,4,7H,2,O 0.2mg / MnSO,4,4H2O 0.1mg /,维生素,B,1,0.1mg /,维生素,H 5ug /,蒸馏水补足,100ml,可以在以上组分上加入,1520g,的琼脂，并补足,1000ml,，并制成固体培养基。,LBG,培养基,Lilly and barnett gelrite,培养基,LB,培养基中以,1%,的,Gelrite,代替琼脂。,注意：在利用和倒入皮氏培养皿（,5mm,）或试管（,5ml,）之前应将所有培养基进行灭菌。,4,2,、子囊孢子释放法,5,3,、组织培养法,6,4,、培养共生菌的保存,共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。,通常共生菌在,1520,时表现出最大生长率。每种均有其最适生长,PH,值，通常,PH,范围为,56,。太高或太低的,PH,均会阻碍其生长。,在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。,地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。,7,二、共生藻及蓝细菌的分离和培养,1、培养基,2、培养前处理,3、共生藻的培养,4、无菌培养群体的分离,5,、共生藻培养的保存,8,1、培养基,BBM,培养基,Bolds Basal Medium,3,N BBM,培养基,Trebouxia,培养基,MDM,培养基,9,2、培养前处理,1,）清洗,对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约,12,，然后放在自来水中浸泡,510,分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。,对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有,12 ml,的无菌水和一滴,Tween,20,的小试管中。超声波粉碎约,3,分钟。离心去除地衣体表面的附属物。,10,2,）地衣体匀浆液的制备,大型地衣（枝状或叶状）：,（,1,）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。,（,2,）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。,（,3,）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。,（,4,）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。,11,较小地衣体：,清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。,12,3、共生藻的培养,含共生藻的悬浊液,15天培养：,15,20,共生藻群（1个月左右）,要注意藻的污染,13,4、无菌培养群体的分离,直接挑选法：体视显微镜,喷雾法,微量吸管吸法,离心法,14,利用喷射法对共生藻进行分离的方法,15,利用微量锡罐分离单个细胞的共生藻,16,5,、共生藻培养的保存,在低光照的条件下，可以培养很长一段时间 （约,1,年） 。最好每,23,个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为,1520,。其生长的最佳,pH,范围是,47,。,（,1,）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部分（约,mm,2,），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿中培养,2-3,个月,.,（,2,）,每,2-3,个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。,17,三、地衣菌、藻共生的人工重建,Stocker-Wrgtter,（,1994,）,地衣体人工重建的基本操作步骤如下：,（,1,）收集你想重建的地衣（如,Peltigera,aphthosa,）基物处的土壤。,（,2,）用筛孔约,12mm,的筛子将,500g,土壤过筛，然后在其中加入,100ml,的二次蒸馏水。,（,3,）将湿的土壤放入,10015mm,的玻璃皮氏皿中，填充高度为,8mm,。对其进行高压灭菌后放置,24,小时，然后再次高压灭菌。,18,（,4,）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种，然后在以上所描述的培养条件下对其进行培养。,（,5,）准备好用于人工重建的分离的共生真菌，并将其转移到无糖的液体培养基上（如,BBM,），然后培养约,1,个月。,（,6,）将匀浆所得的菌丝体覆盖到绿藻或蓝细菌群体上。,（,7,）将重建群体在培养室中培养，培养室条件应同他们共生藻的生长条件一致。,19,思考题：,1,地衣共生菌分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。,2,共生藻的分离培养方法哟哪些？,3,简要说明地衣人工重建的研究进展。,20,THANKS,21,思考题：,1,衣共生菌的分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。,2,共生藻的分离培养方法有哪些？,3,简要说明地衣人工重建的研究进展。,22,