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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,流 式 细 胞 术,细胞生物学教研室,李婉明,流式细胞术（,Flow Cytometry, FCM,）：,是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。,可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内,DNA,、,RNA,含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集,(,分选,),某一亚群细胞，分选纯度,95%,。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。,三个步骤：,第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、,细胞的荧光染色；,（上午实验部分）,第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；,第三，是结果分析阶段。,实验一 流式细胞术检测,5-FU,对大肠癌细胞,HCT116,的细胞周期抑制作用,实验二 流式细胞术检测,CD44,在大肠癌细胞,HCT116,的表达情况,实验一 流式细胞术检测,5-FU,对大肠癌细胞,HCT116,的细胞周期抑制作用,【,实验目的,】,1.,掌握,PI,单染进行细胞周期检测的操作步骤,2.,熟悉,5-FU,对大肠癌细胞的抑制机理,3.,熟悉流式细胞术细胞周期检测的结果分析,4.,了解流式细胞仪的操作原理,【,实验用品,】,(1),大肠癌细胞,HCT116,(2),锡箔纸、离心管、,EP,管、移液器、离心机、流式细胞仪、一次性手套,(3),药物,5-FU,、胰蛋白酶、,70%,乙醇、预冷的,PBS,、染色缓冲液、,PI,染色液、,RNaseA,化疗药物（,5-,氟尿嘧啶，,5-FU,）,最早的抗癌药物之一，在细胞内转化为有效的,5-,氟尿嘧啶脱氧核苷酸（,5F-dUMP,）而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（,dUMP,）甲基化为脱氧胸苷酸（,dTMP,），从而,影响,DNA,的合成,。对多种肿瘤有效，特别是对消化道癌症和乳腺癌疗效较好,.,荧光染料（碘化丙锭,PI,）,是一种双链,DNA,的荧光染料，和双链,DNA,结合后可以发光，并且荧光强度和双链,DNA,的含量成正比。,G1/G0,期具有二倍体细胞的,DNA,含量,(2N),，,G2/M,期具有四倍体细胞的,DNA,含量,(4N),，,S,期的,DNA,含量介于二倍体和四倍体之间。,【,实验内容,】,前一天，细胞加药,(,实验组,),：,实验老师已完成,实验组和对照组,细胞上清培养液分别倒入离心管中（分别做好标记）,胰酶消化,2-3 min,，加入前面收集的细胞培养液，轻轻吹打细胞至完全脱落，,细胞悬液平均分别分两组（两组公用一皿细胞），,分别转移至,1.5EP,管中,（一）细胞收集,1000 rpm,离心,5 min,，小心吸除上清,加入,1ml,预冷的,PBS,，重悬细胞，,1000 rpm,离心,5 min,，小心吸除上清,（二）细胞固定,加入,1 ml,预冷,70%,乙醇，,4,固定至少,2 h,（隔一段时间上下颠倒混匀）,1000 rpm,离心,5 min,，沉淀细胞，,小心吸除上清,加入,1 ml,预冷的,PBS,，重悬细胞，,1000 rpm,离心,5 min,，小心吸除上清,（三）,PI,染色,每管细胞样品中加入,0.3 ml PI,染色液（已配置好），缓慢并充分重悬细胞沉淀,37,避光,温浴,30 min,（包裹锡箔纸）,科研楼,4,楼完成：,将细胞悬液加入流式管中，做好标记，然后进行检测,（分组去，,1/2,组：,13,点,30,；,3/4,组：,14,点；,5/6,组：,14,点,30,；,7/8,组：,15,点）,注意：若不能及时流式检测，,4,或冰浴,避光,存放,【,结果分析,】,对照组,实验组,G1: 69.56%,S: 22.5%,G2: 7.94%,G1: 82.19%,S: 17.81%,G2: 0%,实验二 流式细胞术检测,CD44,在大肠癌细胞,HCT116,的表达情况,【,实验目的,】,1.,掌握细胞表面蛋白标记细胞的操作步骤,2.,熟悉流式细胞术检测细胞表面蛋白表达的结果分析,3.,了解流式细胞仪的操作原理,【,实验用品,】,(1),大肠癌细胞,HCT116,(2),锡箔纸、离心管、,EP,管、移液器、离心机、流式细胞仪、一次性手套,(3) CD44,抗体、,FITC,二抗、胰蛋白酶、预冷的,PBS,CD44:,分布较为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性粘附,即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤侵袭转移中起促进作用。已在人类各种恶性肿瘤的研究中发现,CD44,普遍存在,研究证实，,CD44,可作为肿瘤干细胞的标志物，且与大肠癌的发生发展和侵袭转移密切相关,。,流式细胞术通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。,【,实验内容,】,HCT116,细胞上清培养液分别倒入离心管中（做好标记）,胰蛋白酶消化,2-3 min,，加入前面收集的细胞培养液，轻轻吹打细胞至完全脱落，分别收集至离心管中,（一）细胞收集,1000 rpm,离心,5 min,，小心吸除上清,加入,1ml,预冷的,PBS,，重悬细胞，,1000 rpm,离心,5 min,，小心吸除上清,（二）,CD44,染色,加入,100 l PBS,重悬细胞，分装细胞到两管,EP,管中，每管,50 l,一管加入,50 l CD44,试剂,设为实验组；,一管加入,50 l PBS,，设为对照组，,4,孵育,1 h,（期间颠倒充分反应）,加入,1 ml,预冷的,PBS,，重悬细胞,1000 rpm,离心,5 min,，沉淀细胞,小心吸除上清，,加入,100 l FITC,标记二抗, 4,避光,孵育,30min,（期间颠倒充分反应）,加入,1 ml,预冷的,PBS,，重悬细胞,1000 rpm,离心,5 min,，沉淀细胞,小心吸除上清，,每管加入,300 l PBS,重悬，流式检测,【,结果分析,】,对照组,实验组,
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