荧光定量PCR原理及操作步骤

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,PCRreal time-PCR,定量,PCR,反应体系,actin,achi,aly,vlg,stat,actin,achi,aly,vlg,stat,模板,cDNA,4ul,Tag mixture,10ul,引物,1,0.5ul,引物,2,0.5ul,H,2,0,5ul,1,模板,2,模板, ,443.45,ng/ul,686.75,ng/ul, ,17.738,ng/ul,26.47,ng/ul,定量与常规,PCR,的差别,常规,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应的,终产物,进行定量及定性分析,定量,PCR,技术,：,通过对,PCR,扩增反应中,每一个循环产物,荧光,信号的,实时,检测,从而实现对,起始模板,定量及定性的分析,三个关键词：,实时，定量，荧光,PCR,分四个阶段,如何定量？,Ct,值的概念,Ct,值的定义是,PCR,扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的,循环次数,。,定量原理,确定初始模板的浓度,初始,DNA,量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少,Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,起点定量与终点定量,荧光化学,SYBR Green 1,TaqMan,TaqMan,SYBR Green I,工作原理,。,SYBR Green 1,结合,到双链,DNA,的,小沟部位,SYBR Green 1,染,料只有和双链,DNA,结合后才发荧光,G,T,T,T,G,G,C,C,C,C,C,C,C,A,A,A,G,G,G,A,C,T,T,G,A,T,A,G,C,A,T,C,G,T,A,A,G,T,T,T,T,T,T,G,G,G,G,C,C,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,T,A,C,C,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,未结合,SYBR Green,1 dye,变,性,:,无,荧光信号,SYBR Green I,应用范围,起始模板浓度定量,融解曲线分析,-,可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体,基因型分析,SYBR Green I,优点,SYBR Green I,缺点,PCR,程序指南,UNG,酶使用原理,金牌,Tag,酶活性,参比荧光：管家荧光,ROX,ROX,校正效果,96,孔板设置举例,PCR,曲线,标准曲线,