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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体,南京医科大学,微生物学与免疫学系,卢 春,概述,1,、免疫球蛋白,(immunoglobulin,Ig,),：,1968,和,1972,年,WHO,和国际免疫学会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。,2,、,抗体,(antibody,Ab,),：,B,淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体。,3,、,Ig,与,Ab,的区别和联系：,Ig,是,化学结构上的概念；,Ab,是生物学功能上的概念；所有的,Ab,都,属于,Ig,；,并非所有的,Ig,都具有,Ab,的活性。,免疫球蛋白的基本结构,1,、,Ig,的组成：,由,4,条肽链通过链间,S-S,双硫键连接而成，其中两条分子量较大的链称重链（,Heavy chain,，,H,链,），两条分子量较小链的称轻链（,Light chain,，,L,链）。,2,、,H,链：,据氨基酸（,aa,）,组成及序列的差异（抗原性）将,H,链,分为,5,类，,、 、 、 、 ,链；,其分别对应于，,IgA,、,IgD,、,IgE,、,IgG,、,IgM,五类,Ig,。,第一节,免疫球蛋白的结构和功能,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,3,、,L,链：,据,aa,组成及序列的差异将,L,链分为,2,型，、型， ：为,2,：,1,（人）。,天然,Ig,单体中，两条,重链是同类的，,两条,轻链是同型的。,4,、,Ig,的分区：,（,1,）可变区：,在,Ig,近,N,端,L,链的,1/2,和,H,链的,1/4,（,、,）或,1/5,（,、,）范围内，因,aa,组成及序列变化较大，故称,可变区（,Variable region,，,V,区）。,（,2,）恒定区：,在,Ig,近,C,端,L,链的,1/2,和,H,链的,3/4,（,、,）或,4/5,（,、,）范围内，因,aa,组成及序列变化相对稳定故称,恒定区（,Constant region,，,C,区）。,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,5,、,Ig,的结构域又称功能区,(,Domain,),：,（,1,）,VH,、,VL,：,超变,区,（,HVR1,、,2,、,3,）,、,互补性决定区,（,CDR1,、,CDR2,、,CDR3,）,，,又称,Ig,独特型决定簇,（,Idiotype,）,;,（,2,）,CH1,、,CL,：,是各类、亚类、型、亚型,Ig,遗传标记,所在部位,;,（,3,）,IgG,的,CH2,：,补体,C1q,的结合位点；,IgG,借助,CH2,通过胎盘，发挥被动免疫作用,；,（,4,）,CH3,：,IgG,的,CH3,与中性粒、巨噬细胞表面表达的,Fc,R,结合，完成免疫调理作用；,与,NK,细胞,表面表达的,Fc,RIII,结合，完成,ADCC,作用,；,（,5,）,IgE,的,CH4,：,IgE,的,CH4,与肥大和嗜碱性粒细胞表,面表达的,Fc,R,结合，完成,I,型超敏反,应；,（,6,）绞,链区（,Hinge region,）：,T,Y,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,Fab,（,Fragment of antigen-binding,）,Ag binding,Valence = 1,Specificity determined by VH and VL,Papain,Fc,Fab,Fc,（,Crystalizable,fragment,）,Effector,functions,6,、,Ig,的水解片段,(,木瓜蛋白酶,),F(ab),2,Ag binding,Valence =2,pFc,No,effector,functions,Pepsin,pFc, Peptides,F(ab),2,6,、,Ig,的水解片段,(,胃蛋白酶,),7,、,Ig,的其他成分,（,1,）,J,链 ：（,joining chain,）,由浆细胞合成，功能是将,单体,Ig,分子连接为多聚体。如,2,个,IgA,单体形,成二聚体；,5,个,IgM,单体是形成五聚体。,7,、,Ig,的其他成分,（,2,）分泌片 ：（,secretory,piece, SP,）,由,黏膜上皮细胞,合成和分泌，功能是保护分泌型,IgA,或,的,IgM,铰链区免受蛋白酶的降解。, 五类,Ig,的特点,Ig,的生物学活性,1,、特异性结合抗原,2,、激活补体,3,、与细胞,Fc,受体结合发挥生物效应,（,1,）免疫调理作用,（,2,）,ADCC,（,3,）,介导,I,型超敏反应,（,4,）人,IgG,的,Fc,段与,SPA,结合,4,、选择性传递,Ab,的生物学活性,第二节,免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性,概述,人类,B,淋巴细胞存在三个编码,Ig,的基因库，即重链,H,基因库及,轻链,、 基因库，它们分别,位于第,14,、,2,及,22,号染色体上。,一、胚系,B,细胞中,Ig,轻链基因的结构,由,3,个基因所编码：,V,基因、,J,基因编码可变区；,C,基因编码恒定区，即,V-J-C,。,（一） ,链基因结构,1,、,V,：,V,基因节段有,90,个，呈簇状串联排列（,V1Vn,，,n=90,），,其中含,30,个假基因（指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因，但它可通过突变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样性提供后备基因）。,V,编码,V,区,110aa,中的,196aa,；,2,、,L,序列：,每个,V,前都有一个,L,序列（,Leader,），,编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；,3,、,J,：,位于,V,下游，也呈串联排列，含,5,个基因节段，编码,V,区,110aa,中的,97,110aa,；,4,、,C ,：,只含单个外显子，编码,C,区蛋白。,（二） ,链基因结构,1,、,V,：,V,基因节段有,60,个，呈簇状串联排列（,V 1Vn,，,n=60,），,其中含,30,个假基因,；,2,、,L,序列：,每个,V,前都有一个,L,序列（,Leader,），,编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；,3,、,J1C1,，,J2C2J7C7,：,C1C7,代表各个亚型,链的基因节段，其中含,4,个功能基因节段和,3,个假基因。,二、胚系,B,细胞中,Ig,重链基因的结构,由四个基因所编码：,V,基因、,D,基因、,J,基因编码可变区；,C,基因编码恒定区，即,V-D-J-C,。,（一）,重链,V,区基因,1,、,VH,：,VH,基因节段有,95,个，成簇状串联排列（,VH1,VHn,，,n=95,），,其中含,45,个假基因。每个,VH,前都有一个,L,序列（,Leader,），,其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上。,Ln,VHn,编码疏水前导肽和,CDR1,及,CDR2,；,C,DH(1-23),2,、,DH,，,JH,：,DH,有,23,个节段，成簇状串联排列；,JH,有,9,个节段，其中,6,个功能基因和,3,个伪基因。,DHJH,编码,CDR3,，,JH,编码可变区的骨架部分（,Framework region,）。,C,DH(1-23),（二）,重链,C,区基因,1,、,CH,：,CH,基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的,Ig,在体内成熟的顺序相似，分别是,CC C3C1C1C2C4CC2,。除,C ,以外，其他,CH,基因节段都有一个转换区（,Switch region,，,S,区），其作用是控制,Ig,类型转换；,C,DH(1-23),2,、,控制膜结合或分泌型,Ig,的基因：,每个,CH,基因节段后分别排列着,S,和,M,两基因，,S,即分泌型，,M,即膜结合型，如,CSM,、,C S M ,。,C,DH(1-23),三、,B,细胞分化过程中的基因重排,1,、基因重排定义：,在,B,细胞分化和发育过程中，一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能性的免疫球蛋白基因单位，此过程称,基因重排,（,Gene Rearrangement,）。,功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达为免疫球蛋白。,2,、,可变区的基因重排：,（,1,）重链可变区的基因重排：,选择一个,DH,与一个,JH,节段连接（,DHJH,），,再选择一个,VH,与,DHJH,相连，一旦,VHDHJH,重排成功且得到功能性表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链可变区的基因重排；,C,DH(1-23),（,2,）轻链可变区的基因重排：,链基因优于,链基因重排。选择一个,V,与一个,J,节段连接,VJ,，,其产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制,链基因重排，称为同型排除。当两条染色体上的,链基因重排都失败时，才会启动,链基因重排。两条染色体上的,VH,基因都是无产物重排，或,基因和,基因都是无产物重排，细胞凋亡（,Apoptosis,）。,（,3,） 可变区的基因重排,12,23,规律和重组酶的作用：,可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列（,RSS,）,控制，遵循,1223,规律且与,DNA,损伤修复系统有关。,（,4,）重链类型转换,：,每个,CH,（,C,除外）前都含一个,S,区（短的串联重复序列），,S,区与重链类型转换有关。,在,B,细胞分化过程中,，,V-D-J,的重排及其与,C,的连接是不依赖抗原刺激，重排的,V-D-J,与,C,和,C,连接，经转录加工，此时在,B,细胞表面表达,mIgM,和,/,或,mIgD,。,成熟的,B,细胞在抗原刺激下,，,B,细胞在分泌,IgM,和,/,或,IgD,的,同时，,V-D-J,从与,C,基因连接转换到与,C,或,C,或,C,的连接，完成了类型转换。,C,DH(1-23),2,、,Ig,的多样性：,（,1,） 组合性连接：,重链的,V-D-J,连接（,95,个,V,基因、,23,个,D,基因，,9,个,J,基因）；轻链的,V-J-C,（,90,个,V,基因、,5,个,J,基因、一个,C,基因；,60,个,V,基因、,7,个,J,基因和,C,基因）；,（,2,） 接合多样性：,发生在,D-J,、,V-D-J,、,V-J,连接时，,1,密码子错位；,2,框架（,ORF,）,移位；,3N-,序列插入；,（,3,） 体细胞突变：,体细胞突变也可以产生,Ig,的多样性。,3,、重排过程,第三节,基因工程抗体,（,Genetic Engineering Antibody,）,概述,单克隆抗体,(,McAb,),在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很大的作用，但以下几点限制了抗体的导向治疗：,（,1,）鼠源性,McAb,在人体内易诱导免疫应答；,（,2,）人的,McAb,制备甚为困难。,一、嵌合抗体,（,Chimeric,Antibody,）,原理：,保留鼠,Ig,可变区部分，将其恒定区用人,Ig,取代。,方法：,PCR,克隆,鼠,可变区基因和,人,恒定区基因，,将两,基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并,导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌,合抗体分子。,优点：,亲和力保持良好。,缺点：,含鼠,Ig,可变区的异源性，仍,易诱导人免疫应答,。,原理：,仅保留鼠,Ig,可变区,CDR,部分，将,Ig,其它区域都,用人,Ig,取代。,方法：,CDR,序列的获得通常采用,PCR,技术。,优点：,大大降低了鼠抗体的免疫原性。,缺点：,亲和力不佳。,二、,CDR,移植抗体,（,CDR Grafting Antibody,）,又称重构抗体或改形抗体（,Reshaped Antibody,）,原理：,将鼠,Ig,Fv,中的,VH,和,VL,两肽链用不同的连接物,连接成一条多肽链，称为单链抗体（,ScFv,）；,将两个相同或不同特异性的,ScFv,连接在一个分,子上，就获得了双价,ScFv,。,方法：,DNA,重组技术；共价或非共价交连。,优点：,亲和力保持良好，可针对,2,个不同的抗原表位。,缺点：,容易解离或被组织酶解。,三、,单链抗体（,ScFv,）,和,双价,Sc,Fv,原理：,将鼠,Ig,Fab,基因片段与丝状噬菌体,FUSE5,载体连接，产,物转化大肠杆菌，使,Fab,与噬菌体外壳蛋白基因,III,以融,合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面，构建成噬菌,体表面肽库（,Phage peptide library display,）；,再用特,异性抗原对该肽库进行筛选，获得具有高度抗原亲和力,的,Fab,，,最后进行体外重建。,方法：,DNA,重组技术；,ELISA,。,优点：,亲和力保持良好。,缺点：,容易解离或被组织酶解。,四、噬菌体肽库技术构建抗体片段,Thanks!,
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