菜花DNA的提取及二苯胺检测

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验 菜花DNA的提取及二苯胺检测,1,一. 实验目的,学习DNA提取的原理及方法。,掌握二苯胺方法检测DNA 。,2,二 .实验原理,在浓NaCl（12M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；,在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开,。,SDS可将核蛋白分离出来,3,二苯胺鉴定DNA的化学原理,DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。,4,1核酸分离提取的原则,1）应保证核酸一级结构的完整性,2）排除其他分子的污染,A 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶,剂和过高浓度的金属离子,B其他生物大分子如：排除其他核酸分子的污染,5,2. 核酸提取的步骤,1）破碎细胞（材料不同，方法不同）,匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。,2） 除杂质，提DNA,杂质：蛋白，多糖，脂类，DNase, RNA,A.,DNase的抑制：,EDTA,B. 除RNA,酶法,：加RNase,6,调节pH,：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定，所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。,调节盐浓度(盐的分步沉淀),：,C. 除蛋白,加去垢剂或变性剂,:SDS等,用有机溶剂沉淀，除去蛋白,：,氯仿、异戊醇，酚,加蛋白水解酶,：蛋白酶k,7,D. 除糖，脂类,3.DNA提取注意事项,减少物理因素对DNA的降解。动作轻柔缓慢，尽可能不要剧烈振荡或搅拌.,8,三,.,实验试剂,1，5mol/L NaCl溶液;,2， 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液;,3，25% SDS 溶液；,4，24:1 氯仿异戊醇混合液；,5，3mol/L 乙酸钠0.001mol/L EDTA-Na溶液；,6，95%乙醇；,7，二苯胺试剂：A液：,1.5,克二苯胺溶解于,100ml,冰乙酸中,在加入,1.5ml,浓硫酸,； B液：,.%,的乙醛,实验时，取12/6ml A液，滴入12/6滴B液，混匀使用,9,四. 实验步骤,（一）DNA提取,1,，称取 菜花,5g,用水清洗后，加入,半勺,石英砂粘磨,再加入,10ml,0.14M/LNACL-0.15MEDTA,该溶液，继续研磨至浆状，,2，上述研磨液加入,1毫升,，保温，分钟（间或搅拌）至溶液变粘稠。,3，上述溶液加入的,NaCL溶液,5毫升,，搅拌分钟，再加入,氯仿异戊醇,5毫升,，振摇分钟(轻微），分装4管，平衡后转离心分钟，取上清液。,4，上清液加入,2ml,乙酸钠-EDTA溶液,，加入,2倍,体积的,冰冻乙醇,，用玻棒慢慢搅拌，可看见缠绕在玻棒上,5.待DNA略干燥后，溶于,1ml,.,NaOH溶液,。,10,（二） 二苯胺法检测DNA,1.按照以下表格添加,沸水浴加热10分钟，冷却后观察颜色变化。,试管1,试管2,DNA提取液,1ml,1ml,NaOH溶液,二苯胺试剂,6ml（6ml A+6滴B）,6ml,11,五.实验结果,写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的和原理。,六、实验结果分析讨论,12,