β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,-,内酰胺类抗生素高分子杂质测定法,9/13/2024,1,第一节,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,一、定义,-,内酰胺类抗生素（,-lactam,antibiotics,）系指化学结构中具有,-,内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素（,penicillins,）与头孢菌素（,cephalosporin,），以及近年开发的头霉素类、硫霉素类、单环,-,内酰胺类等其他非典型,-,内酰胺类抗生素。,系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在,1000,5000,，个别可至约,10000,道尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物的分子量。,9/13/2024,2,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,二、分类及来源,按其来源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。,外源性杂质：包括,蛋白,、,多肽,、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。,9/13/2024,3,内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不当也可产生。,抗生素聚合物的,免疫原性,通常较弱，但作为多价,半抗原,，可引发,速发型过敏反应,。,免疫原性,(,immunogenicity,),：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。,抗原性,(,antigenicity,),：抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合的能力。也写作反应原性。,完全抗原：同时具备,2,个性质。天然的蛋白质都是完全抗原。,半抗原,(,hapten,),：只有抗原性而没有免疫原性的物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生的物质，称为半抗原。一般分子量较小，如化学药物。半抗原,+,载体,(carrier),完全抗原,。,速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。,随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对,内源性聚合物,的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。,9/13/2024,4,图,1,水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化,9/13/2024,5,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,三、形成机理及结构特征,（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。,9/13/2024,6,青霉噻唑多肽：,制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在,3500,2400,道尔顿左右，有青霉素的,-,内酰胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理,缩合,而成，主要发生在,发酵工艺,中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与,-,内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身的,水分含量,及,储存温度,有关。,9/13/2024,7,青霉噻唑蛋白的基本结构,青霉素,G,内酰胺环断裂点,9/13/2024,8,青霉素聚合物：,1.,反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。,一分子青霉素首先开环，形成一新的活性位点，并与另一分子青霉素聚合。,2.,侧链参与的聚合反应,主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上的氨基亲核攻击,-,内酰胺抗生素的,羰基碳原子,，形成聚合物。,9/13/2024,9,头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是不同类型的聚合物。,1.,只与母核结构有关的,N,型聚合反应,eg,.,头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等,2.,侧链参与的,L,型聚合反应。,eg,.,头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等,在碱性条件下，两种反应都可以发生。,9/13/2024,10,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,四、结构特点,高度的不均一性和不确定性。,1.,青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质,发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子。,9/13/2024,11,2.,聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同时发生,不同机理,的聚合反应。,3.,形成的聚合物可发生不同程度的分（降）解反应，如开环等。,4.,对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。,5.,实践中发现高分子杂质的种类及数量和,生产工艺,密切相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法的高分子杂质具有不同的特异性，且二者的聚合物含量明显不同。,冻干粉二聚物,溶媒粉二聚物,9/13/2024,12,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,五、影响聚合物形成的因素,1.,青霉素的聚合物,青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的,酸碱度,关系密切；在固体条件下主要和样品的,水分含量,有关。,9/13/2024,13,2.,头孢菌素的聚合物,固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与,含水量,和,贮存温度,的关系密切。,贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至,37,时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。,9/13/2024,14,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必要性,口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素,V,聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要的。,9/13/2024,15,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质,七、抗生素高分子杂质的质控意义,1. -,内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发临床,速发型过敏反应,的过敏原；,2.,高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反应，因此注射剂和口服剂都应控制。,3.,高分子杂质是,-,内酰胺类抗生素质量评价的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此进一步评价其生产工艺。,9/13/2024,16,第二节 高分子杂质分析方法,高分子杂质质控方法,化学分析,免疫学分析,色谱法,分光法（,P,值法）,间接血凝法,豚鼠,PCA,法,反相模式,离子交换模式,凝胶色谱模式,一、概述,9/13/2024,17,由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在药物质量控制中一般,不需,分别控制不同结构的高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子杂质的,总量,。故根据,分子量差异,进行分离的,凝胶色谱模式,是简便易行的分离模式。,以葡聚糖凝胶,Sephadex,G-10,为基础的凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，并满足药品质量控制的需要。,9/13/2024,18,高分子杂质分析方法,二、凝胶色谱系统的分离原理及特点,9/13/2024,19,凝胶色谱系统的分离原理及特点,1.,凝胶色谱法,凝胶色谱法又称,分子排阻色谱法,。凝胶色谱法主要用于,高聚物,的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要,有机溶剂,，对高分子物质有很高的分离效果。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。,9/13/2024,20,凝胶色谱系统的分离原理及特点,2.,凝胶色谱系统的分离原理,（,1,）利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。,9/13/2024,21,凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图,9/13/2024,22,凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以,完全或部分,排阻某些,大分子化合物,于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。,任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用,分配系数,Kav,（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。,9/13/2024,23,实验证明，,Sephadex,G-10,凝胶可基本保证所有的,-,内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。,Kav,= (,Ve,-Vo) / (,Vt,-Vo),Kav,:,分配系数；,Ve,：被分离物质洗脱体积；,Vo,：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体积（外水体积）；,Vt,：柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和（柱床体积）,一般,Kav0,洗脱的组分视作高分子杂质。,9/13/2024,24,外水体积（,Vo,）,：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即液体流动相体积；,内水体积（,Vi,）,：凝胶颗粒中孔穴的体积，即固定相体积；,基质体积（,Vg,）,：凝胶颗粒实际骨架体积。,Vt,= Vo+ Vi,+ Vg,柱床体积（,Vt,）,：凝胶柱所能容纳的总体积,9/13/2024,25,洗脱体积（,Ve,）,：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。,一般是介于,Vo,和,Vt,之间的。,（,1,）对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故,Ve,=,Vo,；,（,2,）对于完全渗透的小分子，由于可以存在于凝胶柱整个体积内，故,Ve,=,Vt,；,分子量介于两者之间的分子，其洗脱体积也介于两者之间，但，有时也出现,Ve,Vt,，这是由于这种分子与凝胶的吸附作用造成的。,9/13/2024,26,凝胶层析洗脱示意图,（,1,）完全排阻的大分子 （,2,）中等分子,（,3,）完全渗透的小分子 （,4,）吸附分子,9/13/2024,27,通常选用蓝色葡聚糖,2000,作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为,200,万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（,210nm,或,260nm,或,620nm,）洗脱体积（即,Vo,）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖,2000,测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用,巨球,蛋白,代替。,9/13/2024,28,Vo,的测定,9/13/2024,29,Vt,的测定,9/13/2024,30,（,2,）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质的表面。,（,3,）在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，因此溶质分子在,凝胶颗粒内部,较,凝胶颗粒外部,更易被吸附。,（,4,）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对,药物分子,的吸附作用,大于,对,高分子杂质,的吸附作用。,9/13/2024,31,有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离度。,（,5,）在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作用及流动相对该相互作用的影响的基础，通过调节色谱过程中的,流动相组成、浓度、,pH,和流速,等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分子间的分离度。,9/13/2024,32,凝胶色谱系统的分离原理及特点,3.,Sephadex,G-10,凝胶色谱法分离,-,内酰胺抗生素中高分子杂质的概况：,在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中，理论上,-,内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质均集中在,Kav,=0,的色谱峰中；调节各种色谱条件，既可使,-,内酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素类抗生素的二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可用于不同的分析目的。,9/13/2024,33,高分子杂质分析方法,三、色谱条件对,-,内酰胺类抗生素在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中色谱行为的影响,9/13/2024,34,色谱条件的影响,1.,流动相离子强度对溶质保留行为的影响：,流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直接联系，但一般说来，当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，,-,内酰胺类抗生素的,Kav,值越大。,9/13/2024,35,在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。,有研究表明，在流动相中添加,中性盐,如氯化钠或,增加,缓冲液的浓度后,，,均使离子强度增加，使,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质得到有效分离。,9/13/2024,36,色谱条件的影响,2.,流动相种类对溶质色谱行为的影响：,常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。,改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶质的色谱行为，对,-,内酰胺类抗生素，表现为其,Kav,值的改变及色谱峰型的变化。,9/13/2024,37,流动相,0.1mol/L,头孢菌素的,Kav,值,头孢他啶,头孢曲松,头孢噻吩,柠檬酸缓冲液,0.45,2.52,2.06,硫酸铵,0.36,1.76,1.45,磷酸缓冲液,0.31,1.36,1.42,醋酸缓冲液,0.27,0.79,1.00,碳酸盐缓冲液,0.21,0.55,0.88,硝酸钠,0.15,0.21,0.58,流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响,9/13/2024,38,测定次数,缓冲盐,0.1mol/L,理论板数,拖尾因子,1,磷酸缓冲液,3191,1.43,柠檬酸缓冲液,2385,2.54,2,磷酸缓冲液,4121,1.43,柠檬酸缓冲液,3120,2.40,流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为的影响,9/13/2024,39,分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲液中的,阴离子种类,，阴离子所带的负电荷越多，溶质的,Kav,值相对越大，色谱峰也越易拖尾。,9/13/2024,40,色谱条件的影响,3.,流动相,pH,的影响,对于弱酸，流动相的,pH,值越小，组分的,k,值越大，当,pH,值远远小于弱酸的,pKa,值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。,当流动相中有多元酸,/,盐存在时，,pH,通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类型，来改变溶质的保留时间。,9/13/2024,41,色谱条件的影响,4.,洗脱速度的影响,流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。,这是由于流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部的概率减小，导致与葡聚糖凝胶相互作用的机会减少之故。,9/13/2024,42,色谱条件的影响,5.,溶质保留值和半峰宽的关系,-,内酰胺抗生素在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中的半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。,9/13/2024,43,第三节 分子排阻色谱法,中国药典,2005,版二部规定，,分子排阻色谱法,是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱的分子筛机制。,-,内酰胺类抗生素中的高分子杂质的测定采用分子排阻色谱法。,9/13/2024,44,自身对照外标法,原理,在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中，由于,Sephadex,G-10,的排阻分子量仅为,700,道尔顿，因此，除部分寡聚物外，,-,内酰胺抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有高分子杂质表现为单一的色谱峰，其,kav,=0,。,9/13/2024,45,自身对照外标法,在特定条件下，,-,内酰胺抗生素由于分子间的氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，可以形成,缔合物,，导致其表观分子量增大。此时，在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在,kav,=0,处表现为单一的色谱峰。,9/13/2024,46,自身对照外标法,测定方法,利用以上所述原理，在,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下,缔合时的峰,响应指标；再改变色谱条件，测定样品高分子杂质和药物分离后，,kav,=0,处,高分子杂质的峰,响应指标；按外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。,流动相,B,：水,流动相,A,：磷酸盐缓冲液,9/13/2024,47,为什么采用自身对照外标法？,定量分析法的理论基础：通过检测器的物质的量与检测器的响应信号成正比，其检测器响应可以是面积或峰高。,含量,响应值,(,A,或,H),定量方法：,外标法,内标法,峰面积归一法,主成分对照法,9/13/2024,48,1.,外标法,以,待测物质的对照品,为参照物，根据供试品的量和对照品的量以及对应的响应信号进行定量的方法。,高聚物对照品较难制备，即使制备的高聚物对照品由于不稳定也较难保存，而且不同批制备的对照品很难同质。,-,内酰胺抗生素高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性。,9/13/2024,49,2.,归一化法,将测得色谱图上，,所有色谱峰,面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰的百分比，把所有的色谱峰的百分比相加即得,100%,，称为峰面积归一化。,对于高分子杂质来说，其含量和药物本身含量相差甚远，测量误差较大。,9/13/2024,50,高分子杂质,样品主峰,9/13/2024,51,3.,内标法,内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标后，按峰面积归一法的分析方法进行分析，这就避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差，因而，它的分析精密度也是比较高的，是气相色谱的一种比较理想的定量分析方法。,9/13/2024,52,4.,主成分对照法,由于,Sephadex,G-10,凝胶色谱分离系统的柱效较低，进样微量的药物很难表现出色谱峰。,9/13/2024,53,基本分析方法,9/13/2024,54,仪 器,1.,恒流泵,1,）转速转速范围：,0.1-120rpm,正反转可逆,2,）调速方式：无级调速配以线性数码旋钮连续可调,3,）速度分辩率：,30rpm,以下为,0.1rpm,，,30rpm,以上为,1rpm,硅胶管,1,）粗细合适,2,）壁厚,1.5mm,3,）耐磨,9/13/2024,55,仪 器,2.,玻璃层析柱,合理选择层析柱的长度和直径，是保证分离效果的重要环节，理想的层析柱的直径与长度之比一般为,1,：,25,1,：,100.,9/13/2024,56,仪 器,3.,检测器,-,内酰胺抗生素通常都有较明显的紫外吸收特征，所以测定中一般选择紫外检测器，通常用到的检测波长是,254nm,。,9/13/2024,57,仪 器,3.,数据处理系统,积分仪,选择性记录,进行积分处理和定量计算,色谱工作站,色谱控制,数据采集,记录,计算,分析,图谱保存,实验结果编排,打印于一体,9/13/2024,58,系统适用性试验,1.,以蓝色葡聚糖,2000,的保留时间来表示高分子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖,2000,溶液色谱峰保留时间的比值均应不超过某一限度。,中国药典要求是,0.93,1.07,。,对照品峰和供试品溶液聚合物峰与相应色谱中蓝色葡聚糖,2000,峰的保留时间的比值也是,0.93,1.07,。,9/13/2024,59,流动相,A,：磷酸盐缓冲液,流动相,B,：水,5.349,5.186,9/13/2024,60,2.,理论板数,在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖,2000,峰计算，理论板数均,不小于,700,。,9/13/2024,61,3.,拖尾因子,在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖,2000,峰计算，拖尾因子均,小于,2.0,。,9/13/2024,62,4.,重复性,RSD,考察对照品在流动相,B,系统中重复进样后峰面积的相对标准偏差应符合规定。,9/13/2024,63,流动相,B,：水,测定对照品，在,Kav,=0,处表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，测定这一条件下缔合时的峰响应指标。,5.305,测定过程,9/13/2024,64,流动相,A,：磷酸盐缓冲液,测定供试品，测定样品中高分子杂质和药物分离后，,Kav,=0,处高分子杂质的峰响应指标。,5.345,9/13/2024,65,影响准确测定的若干因素,1.,峰响应值的选择,2.,检测器类型及其线性范围,3.,进样量的影响,4.,对照品异质性的影响,9/13/2024,66,分离度,定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离能力）。,Hp,次高峰到基线的高。,Hv,次高峰与最大峰曲线分离的最低点到基线的高。,9/13/2024,67,分离度影响因素,1.,凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关,2.,与洗脱剂组成有关,3.,与流动相的离子强度有关,4.,与流动相的,pH,有关,5.,与流动相的流速有关,9/13/2024,68,第四节,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统有关的实验技术,1.,凝胶的预处理,凝胶：,溶胶,或,溶液,中的,胶体,粒子或,高分子,在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的,液体,（在干凝胶中也可以是,气体,），这样一种特殊的,分散体系,称作凝胶。没有,流动性,。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于,弹性凝胶,弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新,膨胀,。,9/13/2024,69,凝胶粒度的选择：,一般来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，选择,适当的颗粒大小,并调整流速。,9/13/2024,70,凝胶溶胀方法：,称取葡聚糖凝胶，缓慢地倾倒入,5,10,倍的,去离子水中,或,蒸馏水,，搅拌均匀，在室温溶胀,6,小时，或,沸水浴溶胀,2,小时,，一般采用后一种方法（能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡） 。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，最后减压抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，准备装柱。,商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的,2,倍，例如,Sephadex,G-20,的吸水量为,20,，,1,克,Sephadex,G20,吸水后形成的凝胶体积约,40ml,。,9/13/2024,71,凝胶再生：,对于不锈钢色谱柱,其方法是,:,先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。,对于玻璃层析柱,其方法是：将凝胶从柱柱中取出，将已使用过的凝胶先用,0.2mol/L,氢氧化钠与,0.2mol/L,氯化钠混合液浸泡半小时后，用水洗至中性，再装柱。,对于长期不使用的硅胶,其方法是：将洗好的凝胶用,50%,乙醇浸泡，抽干，然后，依次用,75%,、,95%,和无水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置,37,烘干后，即可长期保存。,9/13/2024,72,2.,装柱,取层析柱一根，底部用玻璃纤维或砂蕊滤板衬托，并要求滤板下的体积,尽可能小,。将柱垂直至于铁架上，然后在柱顶连接一长颈漏斗（漏斗颈直径约为柱直径的一半）。在柱中加水或洗脱液，并赶净滤板下方气泡，使支持滤板底部完全充满液体，然后将柱的出口关闭。把已经溶胀好的凝胶调成薄浆，从漏斗倒入柱内，胶粒逐渐扩散下沉，薄浆连续加入。,9/13/2024,73,装柱要点：,1,）凝胶浆浓度应适宜（一般为,70%,水混悬液），分散均匀不结团（不宜强烈搅拌）。,2,）一根理想的凝胶柱要求柱中的填料,(,凝胶,),密度均匀一致，没有空隙和气泡。,3,）通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖,2000,溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。,9/13/2024,74,3.,加样,加样方法：,凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数,mL,洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。,9/13/2024,75,加样量：,加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。一般来说，加样量越少或加样体积越小,(,样品浓度高,),，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的,5,10,。样品体积过大，分离效果不好。,9/13/2024,76,4.,洗脱,加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速。,凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。,9/13/2024,77,色谱柱的维护保养,玻璃层析柱：,1.,装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。,2.,始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。,9/13/2024,78,色谱柱的维护保养,3.,葡聚糖凝胶耐受压力为,0.3,兆帕，过高压力会损伤填料性能。,4.,防止柱长霉：可用,20%,乙醇或,0.04%,叠氮钠保存。,5.,防止柱受污染：可用,0.2mol/L,氢氧化钠与,0.2mol/L,氯化钠混合液清洗。,9/13/2024,79,色谱柱的维护保养,不锈钢色谱柱：,1.,在高于室温的条件下使用时，不要在测量完毕立即停泵，应该是继续通流动相直到色谱柱的温度低于室温为止。如果在色谱柱很热的时候停泵，当流动相冷却过程中色谱柱就会进入气泡。,9/13/2024,80,色谱柱的维护保养,2.,若色谱柱在短期内不再使用，应用蒸馏水将含盐的流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。,3.,色谱柱长期不用，应在,4,储藏。若储藏温度低于,0 ,，则会降低柱效。,4.,避免阳光直射，避免与腐蚀性气体接触。,9/13/2024,81,总 结,对抗生素中高分子杂质的分析根据不同品种的特点和不同质控要求灵活掌握，优先采用凝胶色谱法，但不排除其它验证良好的其它分析系统的应用，对不同品种，视分离情况和分离要求，将,Sephadex,G-10,和高效凝胶色谱系统综合应用。,9/13/2024,82,总 结,高效、快速、简便是抗生素高分子杂质测定方法的发展目标，也是必然趋势。在,2005,版中国药典中，发展较为完善的,Sephadex,G-10,凝胶色谱系统对多个品种抗生素高分子杂质的控制有着重要的意义。现在已有专门的,-,内酰胺抗生素聚合物测定仪，对,-,内酰胺抗生素的高分子聚合物检查方法的研究将起到推动作用。,9/13/2024,83,复习题,一、,1. -,内酰胺类抗生素中高分子杂质：对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在,1000,5000,，个别可至约,10000,道尔顿。,2.,分离度：是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离能力）。,9/13/2024,84,复习题,1.-,内酰胺类抗生素中高分子杂质按其来源分为：,和,。（外源性杂质、内源性杂质）,2.,青霉类抗生素高分子杂质有,杂质和,两大类。（蛋白（多肽）类杂质、聚合物杂质）,3.,青霉类抗生素样品在储存过程中，多肽类杂质不断生成，其反应速度与,和,有关。（水分含量、储存温度）,4.-,内酰胺类抗生素中高分子杂质具有,性和,性。,5.,青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和,关系密切；在固体条件下主要和,含量有关。,(,溶液的酸碱度、样品的水分,),6.,葡聚糖凝胶耐受压力为,，过高压力会损伤填料性能。,(0.3,兆帕,),7.,色谱柱在短期内不再使用，应用,将含盐的流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。（蒸馏水）,8.,色谱柱长期不用，应在,储藏。若储藏温度低于,0 ,，则会降低柱效。（,4,）,9/13/2024,85,复习题,1.,内酰胺类抗生素高分子杂质测定中影响分离度的因素（,ABCD,）,A,与洗脱剂的组成有关,B,与流动相的离子强度有关,C,与流动相的,PH,有关,D,与流动相的流速有关,2.,当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，,-,内酰胺类抗生素的,Kav,值（,B,）。,A.,越小,B.,越大,C.,不变,D.,没有影响,3.,当改变流动相的离子种类时，其,Kav,值会随之变化，决定这种变化的因素是流动相中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的,Kav,值相对（,B,）,A.,越小,B.,越大,C.,不变,D.,没有影响,4.,在色谱过程中，除分子排阻作用外，凝胶对药物分子的吸附作用与对高分子杂质的吸附作用相比（,C,）,A.,小于,B.,等于,C.,大于,D.,不一定,9/13/2024,86,复习题,1.,简述影响,-,内酰胺类抗生素中高分子杂质形成的因素？,1),青霉素的聚合物,的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和样品的水分含量有关。,2),头孢菌素的聚合物,固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系密切。,贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至,37,时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。,9/13/2024,87,复习题,2.,简要说明凝胶色谱分离的原理？,利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。,9/13/2024,88,复习题,3.,简述影响,-,内酰胺类抗生素高分子杂质测定中分离度的因素？,1,）流动相离子强度对溶质保留行为的影响：,离子强度越大，,-,内酰胺类抗生素的,Kav,值越大。,2,）流动相种类对溶质色谱行为的影响：,缓冲液中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的,Kav,值相对越大，色谱峰也越易拖尾。,3,）流动相,pH,的影响,当流动相中有多元酸,/,盐存在时，,pH,通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类型，来改变溶质的保留时间。,4,）洗脱速度的影响,流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。,9/13/2024,89,复习题,4.Sephadex G-10,凝胶色谱系统试验中凝胶的预处理要求？,1,）新使用的凝胶：充分溶胀，室温,20,需,3,小时以上，煮沸需,1,小时，凝胶充分溶胀后漂去细粒。,2,）已使用的凝胶再生：先用,0.2mol/L,氢氧化钠与,0.2mol/L,氯化钠混合液浸泡半小时后，用水洗至中性，再装柱。,对于长期不使用的硅胶,其方法是：将洗好的凝胶用,50%,乙醇浸泡，抽干，然后，依次用,75%,、,95%,和无水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置,37,烘干后，即可长期保存。,9/13/2024,90,复习题,5.,简述凝胶色谱柱的维护保养注意事项？,1,）葡聚糖凝胶耐受压力为,0.3,兆帕，过高压力会损伤填料性能。,2,）防止柱长霉：可用,20%,乙醇或,0.04%,叠氮钠保存。,3,）防止柱受污染：可用,0.2mol/L,氢氧化钠与,0.2mol/L,氯化钠混合液清洗。,9/13/2024,91,例 题,某,0.25g,青霉素,V,钾胶囊的平均装量为,0.3755g,，为测定其聚合物，取装量差异项下的内容物,600.3 mg,，加,pH7.0,磷酸盐缓冲液溶解并稀释至,10ml,，滤过，取续滤液作为供试品溶液，立即精密量取,200,l,，注入色谱仪，以,pH7.0,磷酸盐缓冲液为流动相进行测定，记录色谱图，聚合物峰的峰面积为,9528,；另精密称取青霉素,V,对照品,(,青霉素,V,含量为,89.2%)20.02mg,，加水溶解并定量稀释制成,100ml,，取,200,l,注入色谱仪，以水为流动相，同法测定，其峰面积为,32178,。按外标法以峰面积计算，含青霉素,V,聚合物（青霉素,V,计）占标示量的百分比。,9/13/2024,92,式中：,C-,待测物浓度,A,t,-,供试品中待测物峰面积或峰高,C,t,-,供试品浓度,A,s,-,对照品峰面积或峰高,C,s,-,对照品浓度,P-,对照品含量,外标法,9/13/2024,93,式中：,A,t,-,供试品中聚合物峰面积,C,t,-,供试品浓度,A,s,-,对照品峰面积,C,s,-,对照品浓度,P-,对照品含量,自身对照外标法,9/13/2024,94,=0.088%,=0.13%,9/13/2024,95,例题,基线积分，峰高：,2.2,峰谷：,0.6,问：分离度是否达到要求？,9/13/2024,96,Thanks for your attention!,9/13/2024,97,