蔗糖酶的催化反应

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蔗糖酶的催化反应及活力测定,1,一,.,实验目的,1,.,学习掌握,3,，,5-,二硝基水杨酸比色,定糖的原理和方法；,2,.,学习掌握酶的活力测定及其计算,方法。,2,二,.,实验原理,蔗糖酶活力测定的原理,1.,蔗糖,D-,果糖,+,D-,葡萄糖,（非还原糖） （还原糖）,2.,酶活力,=,酶活力单位,/ml=U/ml,3.,酶活力单位：在本实验条件下，每,min,释放,1mg,还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位,1U=1mg/min,蔗糖酶,3,二,.,实验原理,3,，,5-,二硝基水杨酸比色定糖的原理,1.,DNS,试剂,+ D-,葡萄糖 氨基化合物,（还原糖） （棕红色）,2.,在一定范围内,还原糖,的量与棕红色物质的颜色强度成正比关系，利用分光光度计，在,540nm,波长下测定吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的量,强碱性溶液中,沸水浴中,4,三、试剂和器材,（一）试剂：,1.,蔗糖酶溶液,2. 5%,的蔗糖溶液,3. DNS,（,3,5,二硝基水杨酸试剂,),4. 1mol/L,的,NaOH,溶液,5. 2mg/ml,的葡萄糖标准液,（二）器材：,1,移液管、吸耳球,2,试管、血糖管（或刻度试管）,3,秒表,4,沸水浴,5,恒温水浴,6,分光光度计 、比色杯、镜头纸、滤纸,5,四、操作步骤,1,、,DNS,比色定糖法工作曲线的制作,取,6,支血糖管编号,0,5,，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（,0.2%,）、蒸馏水、,DNS,试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应,5,分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；用秒表记时），取出后立即放入装冷水的大烧杯中冷却，加蒸馏水定容至,25ml,，摇匀，测定,540nm,处的,A,值。,以葡萄糖,(mg),含量为横坐标、,A540,值为纵坐标，画出工作曲线。,6,7,制作工作曲线的注意事项,1.,分光光度计的使用：,测样时,光吸收值,A,应在,0.100,0.700,之间，并小于标准曲线的最大值，否则，缩小,or,加大样品的稀释倍数，重测！,2.,比色杯的使用：,向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到比色杯的,2/3,处；,如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸向一个方向檫至透明；,倒出液体后，一定要用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸上吸干；,任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上；,自备废液杯（盛废液及废纸块用）,8,2.,蔗糖酶的活力测定,取酶液,2ml,按,2,倍稀释，分装两支试管，每支试管,2ml,，一支中加入,0.5ml 1mol/L,的,NaOH,，摇匀，使酶失活（做参比），另一支做测定管；,把两支试管和,5%,的蔗糖溶液都放在,35,水浴中预热恒温；上述两试管中分别加入,2ml 5%,的蔗糖液，并,准确计算,时间，,3,分钟后于测定管中加入,0.5ml 1mol/L,的,NaOH,，摇匀，终止反应。,9,从反应混合物中取出,0.5ml,溶液放入血糖管中，加入,3ml 3,5,二硝基水扬酸试剂和,1.5ml,水，摇匀。于沸水浴中准确反应,5min,，立即,放入装冷水的大烧杯中,冷却，加水稀释至,25ml,，摇匀，,于,540nm,处测吸光度,在葡萄糖标准曲线上找到所测定吸光度值对应的葡萄糖含量，计算酶活力,10,五、结果及数据处理,11,