4.现代分离技术

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,从现行教育看我国和诺贝尔的距离,截至,2004,年，美国共有,278,位诺贝尔奖获得者。美,国人口占世界人口总数的比例不到,5,美国获得诺贝尔科学奖的人数却占全球获得该奖人数的,70,以上,制约我们获诺贝尔奖的关键因素在于我们缺乏创新精神,创新精神的缺乏是由我国的现行教育体制所决定的。在现行教育体制下，衡量一个学校办学水平高低的唯一指标就是升学率。在高考指挥棒的指挥下，学校的一切工作重心都是为了提高升学率，死记硬背成了夺取高分的法宝,.,即使我国的中学生在国际奥林匹克竞赛中频频获奖，但那也是在预做了大量高难度的习题后的结果；他们的创新思维没有得到任何提高，根本无法形成创新精神。,教师常常自觉或不自觉地追求现成结论或知识成品,在小学和中学阶段，美国在世界上的排名仅在第,28,位或,30,位，落后于所有斯堪的纳维亚国家、瑞士、法国和德国。但在诺贝尔奖的排名上，美国是世界排名第一，而且，这个第一还将多年保持下去,.,今年获得诺贝尔生理学或医学奖澳大利亚科学家巴里,马歇尔和罗宾,沃伦为例：虽然沃伦早在,1979,年就获得了对,幽门螺杆菌,的初步发现，但因,有悖于当时的医学认识,而在相当长的时间里不为人所承认，为了证明致病机理，马歇尔甚至喝下了含有病菌的溶液，结果是大病了一场，这种为了科学实验而不惜用自己身体做,实验,的“固执己见”的创新精神和为科学献身的精神，为他们赢得了世人的尊重和终获诺贝尔奖。,色谱分离法,色谱分离法,按固定相所处的状态分类：,柱层析：将固定相装填在金属或玻璃制成的管柱中，做成层析柱以进行分离的，为柱层析；,毛细管色谱：把固定相附着在毛细管内壁，做成色谱柱的，为毛细管色谱。,纸层析：利用滤纸作为固定相以进行层析分离的为纸层析。,薄层层析：把吸附剂粉未铺成薄层作为固定相以进行层析分离的为薄层层析。,按色谱分离的原理分类,吸附色谱： 固定相为吸附剂，利用它对被分离组分吸附能力强弱的差异来进行分离。气固色谱和液固色谱属于这一类。,分配色谱：是利用各个被分离组分在固定相和流动相两相间分配系数的不同来进行分离的，气液色谱和液液色谱属于这一类。,离子交换色谱：以离子交换剂作固定相，利用各种组分的离子交换亲和力的差异来进行分离。,凝胶色谱：又称排阻色谱： 用凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分所产生阻滞作用的差异未进行分离。,的,平衡常数,K,D,=Cs/Cm,由吸附剂表面对液体中各组分吸附能力,(,K,D,),不同，而按一定顺序被流动相洗脱，从而将各组分分开。,K,D,小的,组分先流出,.,吸附平衡,Cm,(,流动相,),Cs,(,固定相,),吸附剂,粒度均匀的细小颗粒,较大的表面积和一定的吸附能力,吸附剂与欲分离的试样和所用的洗脱剂不起化学反应,不溶于洗脱剂中,常用的吸附剂有,氧化铝,硅胶,聚酰胺,氧化铝,氧化铝具有吸附能力强、分离能力强等优点,。,中性氧化铝,适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离,酸性氧化铝,适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及对酸稳定的中性物质的分离,碱性氧化铝,适用于分离碱性化合响如如生物碱、醇以及其它中性和碱性物质,氧化铝的活化,活性和含水量密切有关,活性强弱用活度级,I,V,级来表示，活度,I,级吸附能力最强，,V,级最弱。,通过加热至不同温度，可以改变氧化铝的活性。,100-150,C,V-VI,150-300 C,III-II, 300-400,C,II-I.,分离弱极性的组分选用吸附活性强一些的吸附剂，分离极性较强的组分，应选用活性弱的吸附剂,硅胶,硅胶具有微酸性,吸附能力较氧化铝稍弱,可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。,硅胶的化学组成,硅氧烷不具吸附性,硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键，因而具有吸附性,其中活泼型硅醇基构成最强烈的吸附中心，游离型次之，束缚型又次之,表面空穴较小的硅胶吸附性能较强,硅胶的活化,水与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇：,Si,0H.0H,2,，,使其失去吸附性能,加热至,100,左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化,最佳的活化条件为：,105,110,，加热,30min,如果加热至,200,以上，则硅胶逐渐失去结构水，形成硅氧烷， 吸附能力下降,加热至,400,以上，硅胶的表面积逐渐变小，以至于烧结。,聚酰胺,由已内酰胺聚合而成，又称聚己内酰胺,聚酰胺分子内存在着很多的,酰胺键,，可与酚类、酸类、酮类，硝基化合物等形成氢键，因而对这些物质有吸附作用,酚类和酸类以其,羟基或羧基,与酰胺键的,羰基,形成氢键,芳香硝基化合物和醌类化合物是以,硝基或醌基,与酰胺键中,游离胺基,形成氢键,聚酰胺吸附规律,能形成氢键基团,(,酚类、酸类、酮类，硝基化合物,),较多的溶质，其吸附能力较大,对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附能力增大,邻位的使吸附能力减小,芳香核具有较多共轭双键时，吸附能力增大,能形成分子内氢键者，吸附能力减小,流动相及其选择,流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程,使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离。就必须根据,试样的性质,，吸附剂的,活性,，选择适当,极性,的流动相,流动相极性较弱,时，可使,试样中弱极性的组分,洗脱下来，在,层析柱中移动较快,，而与极性较强的组分分离。,强极性和中等极性的流动,相适用于,强极性和中等极性组分的分离,组分极性的一般规律,常见的功能团极性增强次序,烷烃,烯烃，醚类,硝基化合物,二甲胺,酯类,酮类,醛类,硫醇,胺类,酰胺,醇类,酚类,羧酸类,当有机分子的基本母核相同时，,取代基团的极性增强，整个分子的极性增强,；极性基团增多，整个分子的极性增强。分子中双键多，吸附力强，共轭双键多，吸附力增强。,分子中取代基团的空间排列对吸附性能也有影响，如同一母核中羟基处于能形成内氢键位置时，其吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。,流动相按其极性增强顺序,石油醚,环,己烷,二硫化碳,四氯化碳,三氯乙烯,苯,甲苯,二氯甲烷,氯仿,乙醚,乙酸乙酯,乙酸甲酯,丙酮,正丙醇,乙醇,甲醇,吡啶,酸，水,溶剂按不同配比配成混合溶剂可以调节溶剂的极性，优化流动相,溶解试样用的溶剂，其极性应与流动相接近，以免因它们极性相差过大而影响层析分离,实验方法,干法装柱,：将,1.530 cm,色谱柱洗净、干燥，柱底铺一层玻璃棉或脱脂棉，再铺一层约,5,8mm,厚的砂，填平。称取,5 g,级,III,级活性的中性氧化铝（,60,80,目）。装入柱管内，使之装填均匀。将粗产品溶于,0.5,mL,二氯甲烷中，加入,300 mg,氧化铝，振荡均匀得浆状物。在通风柜中，在干燥氮气流下除去溶剂至恒重，得到松散的颗粒状产物，精确称取,1/2,重量的颗粒状产物，用作柱色谱分离。,通过柱色谱分离乙酰二茂铁,二茂铁及其衍生物是一类很稳定而且具有芳香性的有机过渡金属配合物。这类化合物的研究是当前化学中一个很活跃的领域。,二茂铁与乙酸酐反应可制得乙酰二茂铁或双乙酰基取代物，如以乙酸酐为酰化剂，磷酸等为催化剂，主要生成一元取代物，但有副产品,1,，,1,二乙酰基二茂铁。,原理,根据,二茂铁、乙酰二茂铁和,1,，,1,二乙酰基二茂铁,对活性氧化铝吸附力的差异而进行的。,色谱柱分离二茂铁及其衍生物时经溶剂展开呈现谱带，因,二茂铁吸附力最弱,，谱带位于色谱柱下端，呈黄色；中间谱带呈橙色为乙酰二茂铁；,1,，,1,二乙酰基二茂铁吸附力量强，色谱带呈棕色，位于色谱柱上端。,用,极性不同的溶剂,可分别洗脱，从而达到分离纯化的目的。,洗脱,：,洗脱液面不能低于最上层固体物质，到洗脱结束。,缓慢滴入,己烷,逐渐展开得到黄色、橙色分离的色谱带。,黄色的二茂铁谱,带首先从柱下流出，用已称重的锥形瓶收集洗脱溶液。,当黄色谱带完全洗脱下来时，改用,1:1,（,V/V,）,的二氯甲烷,己烷混合液洗脱,，同时橙色色带往下移动。逐渐改变溶剂的比例到,9:1,（,V/V,）,二氯甲烷,己烷混合溶剂时，则将橙色色谱带完全洗脱下来，用另一只已称重的锥形瓶收集洗脱液。,最后改用,V/V,为,9:1,二氯甲烷,甲醇,洗脱，可以看到很淡的、很少量的棕色色带向下移动，将该洗脱液另行收集。,薄层色谱法也是,吸附,色谱,薄层色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法。薄层色谱展开装置如下图。,薄层层析法的操作方法,制板,薄层吸附色谱中常用的吸附剂（或载体）和柱色谱用的一样，有氧化铝和硅胶等。,点样,在铺好了的薄板一端约,1.5,厘米处。划一条线，作为起点线。用毛细管吸取样品溶液，垂直地轻轻接触到薄层的起点线上。,展开,在密闭的层析缸中进行，加入,5,mL,展开剂,(,二氯甲烷,),，并在内壁放入二个半张,12 cm,滤纸，盖上盖子，让展开剂蒸气饱和,5,10 min,。,将点好样的薄板小心地放入烧杯中展开。当展开剂上升到薄层的前沿时取出薄板，计算出,R,f,值。观察色斑的大小变化，以判断反应进程,。,注意事项,薄层板的制备,：薄层板制备的好坏是,TCL,成败的关键。薄层必须尽量均匀且厚度（,0.25,1 mm,）,要固定。否则，色谱结果也不易重复。,薄层板的活化,：薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。活化一般在烘箱内慢慢升温，在约,105,活化,30,60 min,，,其中氧化铝薄层干燥后，在,200,220 ,烘,4 h,，,可得约,II,级活性的薄层。,150,160,烘,4 h,可得约,III,V,级活性的薄层。,活性板应干燥器中保存备用,。,点样,：,样品溶液一般以氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、苯、乙醚或四氯化碳等作溶剂，配成,1%,溶液。,如溶液太稀，一次点样不够，等第一次点样干后，再点第二次、第三次。点的次数依样品溶液浓度而定，一般为,2 5,次。,若溶液太浓，量太多时易造成斑点太大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。,点样后的斑点直径一般不超过,0.5 cm,。,若为多处点样时，则点样间距为,1,1.5 cm,。,显色,： 展开完毕，取出薄层板，划出前沿线,化合物本身有颜色,就可直接观察它的斑点,化合物本身无色,在紫外线下观察有无荧光斑点，用小针在薄层上划出斑点的位置,在溶剂蒸发前用,显色剂,喷雾显色。不同类型的化合物需选用不同的显色剂。,将薄层板除去溶剂后，放在含有少量,碘,的密闭容器中显色来检查色点，,许多化合物都能和碘,成棕色斑点。但当碘蒸气挥发后，棕色斑点即易消失（自容器取出后，呈现的斑点一般于,2,3 s,内消失）,显色后，应立即用铅笔或小针标出化合物的位置,。,比移值,(,R,f,),比移值,(,R,f,),是斑点的中心到原点的距离,b,与展开剂前沿到原点中心的距离,a,之比：,R,f,= a / b,R,f,值 与样品化合物及展开剂的性质、温度和吸附剂（或支持剂）种类等因素有关。但在上述条件固定的情况下，,R,f,对某一种物质来说是一个特性常数。不同物质,R,f,值相差越大，分离效果越好。,根据色斑颜色和大小判断化学反应进程,二茂铁吸附力最弱,呈黄色,比移值,(,R,f,),最大,乙酰二茂铁吸附力适中，橙色色斑位于薄层板中间。,1,，,1,二乙酰基二茂铁吸附力量强，比移值,(,R,f,),最小，棕色色斑位于薄层板下端,分配色谱（柱层析）,分配层析是根据欲分离组分在两种互不混溶（或部分混溶）溶剂间溶解度的差异来实现的。,在层析中。这两种互不混溶的溶剂之一是,流动相,；另一种是吸收在载体或担体（往往也叫它们称为吸附剂）中的,溶剂,，这种溶剂在层析过程中不流动，是,固定相,。,分配色谱的担体,担体也称吸附剂，起负载固定相的作用，本身是惰性的。,化学惰性的多孔性固体颗粒，具有较大的比表面积,条件：,比表面积大，孔径分布均匀；,化学惰性，表面无吸附性或弱吸附，与被分离组份不起反应,高的热稳定性和机械强度，不易破碎；,颗粒大小均匀。一般常用,6080,目、,80100,目。,分配柱层析中常用的担体有如下几种：,硅胶,:,在分配柱层析中用作担体的硅胶应在较低温度下活化，使其表面残留一定量的水分作固定相。,纤维素,:,纤维素上有许多羟基，易与水形成氢键而将水吸附，这种吸附着的水分形成分配柱层析中的固定相。,硅藻土,:,系天然存在的非晶形硅胶，其中除,SiO2,外还含,Al2O3, Fe2O3,CaO, Na2O,和有机物及水分等。需经净制才能供层析用。,色谱固定相,=,担体（支持体，载体）,+,固定液,固定液：高沸点难挥发有机化合物，种类千种,。,对,固定液的,要求：,对被分离试样中的各组分具有适当的且不同的溶解能力,较好的热稳定性，使用温度下呈液体状态,难挥发，以免流失,不与被分离组分发生化学反应,固定液选择,基本原则 “相似相溶”，选择与试样性质相近的固定相,一般规律,分离非极性物质，选非极性固定液，按沸点次序，沸点低先出峰。,分离极性物质，选极性固定液，按极性次序，极性低先出峰。,分离极性、非极性混合物，选极性固定液，极性低先出峰。,正相色谱,固定相为,强极性亲水性溶剂,水,稀硫酸,甲醇,甲酰胺等,流动相,一般是与水不相混溶的有机溶剂正丁醇、正戊醇、加入适量的弱酸和弱碱如乙酸吡啶等调节,pH,值以防止被分离组分离解,并提高分配比,。,在,有机溶剂中溶解度大的移动快,。,使用范围,溶于水的有机物，如糖类、氨基酸等的分离,纸层析分离,20,种,氨基酸,先用酚,-,水（,7,：,3,）展开剂,再用丁醇,-,醋酸,-,水（,4,：,1,：,2,）二次展开,反相色谱,使用范围,分离,亲脂性的有机物,，如芳香油等,固定相为,疏水性的有机物，如石蜡油、硅油、正十二醇,流动相,亲水性溶剂作流动相，如水，甲醇，乙醇等,应用举例：纸层析分离,氨基蒽醌异构体,固定相,-,溴代萘，,流动相,-,吡啶,-,水（,1,：,1,），,从上到下依次为：橙色的,1-,氨基蒽醌，粉紫色,1,8,-,氨基蒽醌,红色,1,6,-,氨基蒽醌和橙黄色的,1,7,-,氨基蒽醌，在,亲水性溶剂中溶解度大的移动,快。,萃取色谱法,固定相,有机萃取剂,(TBP),担体,硅胶、硅藻土、玻璃粉、,氧化铝等多孔、疏水、惰性的物质,流动相,无机酸和相应盐的水溶液,优点,液,-,液萃取分离的高选择性与层析分离的高效能相结合。 是实现多级萃取分离的最简单最有效的方法。,缺点,固定相在担体上的牢固程度欠佳，影响柱的寿命，也影响分离性能,镧系元素的萃取色谱分离图,TBP,为固定相，,12.3 mol/L HNO,3,为流动相,离子交换分离法,利用离子交换剂（树脂）与溶液中离子间发生交换反应而进行分离的方法。,特点：,分离效率高,（不同电荷、相同电荷、性质相近与否）,富集比例高,成本低,（大多能再生反复使用）,离子交换树脂,的种类,离子交换反应发生在离子交换树脂上的具有可交换离子的活性基团上。离子交换树脂是以高分子聚合物为骨架，反应引入活性基团构成。高分子聚合物以苯乙烯,-,二乙烯苯共聚物小球常见，可引入各种特性的活性基团,(,如,-SO,3,H, -OH, -N(CH,3,),3,Cl),，,使之具有选择性。,类型,适用范围,举例,优点,缺点,阳离子 交换树脂,强酸型,酸性、中性、碱性,-SO,3,H,应用广,型弱酸,中性、碱性,-COOH -OH,易洗,脱、应用广,阴离子 交换树脂,强酸型,酸性、中性、碱性,-N(CH,3,),3,Cl,应用广,稳定性不如 阳离子交换剂,型弱酸,酸性、中性,-NH,2,螯合树脂,选择性高,制备难、成本高交换容量低 速度低、难再生,大孔,树脂,非,极性,中极性,极性,有机物,离子易扩散 富集速度快 有较高稳定性,氧化还原树脂,氧化还原反应,不,引入杂质 纯度高,萃淋,树脂,TBP,兼有,离子交换法及萃取法的双重优点,纤维交换剂,提纯分离蛋白质、 氨基酸、酶、 激素 及富集无机离子,膦酸,纤维素,稳定性高 交换速度快 易洗脱,网状树脂结构：,由苯乙烯和二乙烯苯交联聚合而成,交联度和,交换容量,交联度,结构中长链由苯乙烯聚合而成，长链间由二乙烯苯交联起来，形成网状结构。二乙烯苯是交联剂，树脂中二乙烯苯的质量百分率，就是树脂的,交联度,交联,度,:,树脂内交联剂的百分含量，以,4%14%,为宜,性质,交联度,对,水 溶,胀性,网眼,交换 反应 速度,交换 选择性,机械 强度,小,好,大,快,差,差,大,差,小,慢,高,高,交换容量,每克离子交换树脂在交换能交换离子的物质的量，,就是,树脂的,交换容量，,一般为,3-6 m mol / g,干树脂。,树脂对不同离子亲和力大小具有如下规律：,(1),稀溶液中，离子电荷越大，亲和力越大；,(2),相同电荷时，水合半径越小，亲和力越大；,二、离子交换树脂的亲和力,交换过程,：,树脂预处理,装柱,交换,洗脱,再生,始漏点,流出液中开始出现被交换离子（交界曾到达柱底部）的瞬间。,始漏量,始漏点,时柱上所交换的离子的量。,始漏量永远小于交换容量。,影响始漏量的因素,交换柱形状,(,细长,),树脂颗粒大小,(,细,),温度,(,高,扩散快,),洗脱过程,相同电荷离子的分离,离子交换树脂的亲和力,顺序,三、,离子交换分离法的应用,1.,蛋白质纯化,为了研究某一个蛋白质的结构，必须首先将,该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化,出来。用于分离蛋白质的最重要特性有,大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性,。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。,离子交换层析,在纯化蛋白质的层析手段中使用最为广泛。它对蛋白质的分辨率高，操作简易，重复性好，成本低。按照离子交换原理，蛋白质可从大量缓冲性溶液中被分离，所以此方法尤适于蛋白质粗提物的初始纯化。,离子交换树脂的选择以层析条件下,蛋白质所带净电荷为根据,。带负电荷的蛋白质会与阴性离子交换树脂结合；带正电荷的蛋白质会与阳性离子交换树脂结合。,在离子交换时,带负电荷的,蛋白质溶液进入离子交换柱后，,蛋白质,取代了与阴离子交换树脂结合的氯离子,通过静电引力可逆地结合在离子交换树脂上。,不同蛋白质与树脂的亲和力各不相同，可用逐渐增加,洗脱液,中,NaCl,浓度的方法将两种蛋白质完全的分离开。,比如，当,带负电荷的,蛋白质溶液进入离子交换柱后,当,洗脱液中氯离子浓度,为,0,3 mol,L,时，与树脂结合力,较弱的蛋白质将被洗脱,，当洗脱液中氯离子浓度提高到,0,5 mol,L,与,树脂结合力较强的蛋白质被洗脱,。,离子交换层析装置,电 泳 法,带电质点在直流电场作用下，向着其电荷性质相反方向移动。根据带电质点移动速度不同来分离混合物中各组分的分离分析方法称电泳法。生物化学中许多物质如蛋白质、核苷酸等等，在一定,pH,值的溶液中都带一定电荷，因而电泳法广泛地用于这些物质的分离与分析中。电泳法也可用于分离无机离子。,基本关系式,在直流电场作用下，驱使质点在介质中前进的作用力,F,是带电质点所带的净电荷,Q,与电场强度,X(V/cm),的乘积,F=QX,而球形质点在溶液中移动时的摩擦力,f=6r,，,式中，,r,是质点的半径，,是移动速度,(cm/s),，,是溶液的粘度。当质点在溶液中恒速移动时，驱使它前进的作用力等于摩擦力；即：,QX=6r,。,带电质点在,电场中的迁移率,m,（,即淌度,cm,2,/s.v,）,是表示带电质点在电场中行为的一个重要参数，它的定义是单位电场强度作用下，带电质点的移动速度，于是：,m=/X,=,Q/6r,电泳基本原理,m=,/,X= Q/6,r,由于在同一电泳系统中,是常数值，不同带电质点，,由于所带净电荷,Q,和质点半径,r,不同,，迁移率也就不同。电泳法就是利用质点迁移率的不同来进行分离的。,电泳的基本概念是很简单的，但带电质点在支持介质中的迁移过程却受到许多因素,(,缓冲溶液的离子强度、,加于系统的功率的大小、,电渗流）,的影响，因此情况是复杂的，电泳条件的确定需要经过细致的选择与探索。,影响因素,介质的,PH,值 在生化分析中多数的分子既可成为阳离子，又可成为阴离子，亦可同时成为阳离子和阴离子，是为两性离子。,带不同电荷的两种基团的离解常数常相差很大，因而这种分子最终带什么电荷，以及电荷的多少，决定于溶液的,PH,值。,例如甘氨酸在溶液中随着,pH,的改变，存在如下的离解平衡,溶液,pH,值对氨基酸蛋白质净电荷的影响,如果当介质的,pH,值为某一定值时，质点的正负电荷数量相等，质点的净电荷为零，这时介质的,pH,值是为该组分的等电点，这时迁移停止。,甘氨酸的等电点则为,6,0,。,谷氨酸分子带什么电荷，所带净电荷的多少，由溶液的,PH,值决定。,生物化学中的许多物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等等都具有这种两性电离的性质。,由于介质的,PH,值严重影响质点的迁移率，因此电泳时介质中必须加入缓冲溶液以控制一定的,PH,值,使各组分所带净电荷相差较大，易于分离。,缓冲溶液的离子强度,应有一定的离子强度，使缓冲溶液有一定的缓冲容量，保证,pH,恒定。,但,缓冲溶液的离子强度不宜过高,。,当缓冲溶液的离子强度增大时，介质的电导增大，电流增大，电泳过程中产生的,热量增加，使温度升高,，既使带电质点的扩散增加，也使迁移率增大。据测定温度升高,1,C,，,迁移率增加,2,4,。同时温度增加时，介质的粘度下降，电阻下降，在恒定的电压下使电流增大，产生的热量进一步增加。因此选择缓冲溶液的离子强度十分重要。,在溶液中，溶质分子存在扩散现象，其扩散系数,D,i,可由下式估算,：,D,i,=,k,T,/6,Na,(1.8),式中,k,为,Boltzmann,常数，,T,为温度，,为溶液粘度，,N,为,Avogadros,数，,a,为分子体积。从此公式可以得到，温度越高，溶液粘度越低，分子体积越小，则扩散系数越大。,电泳的发展历程,：溶液中进行的界面电泳,聚丙烯酸胺凝胶,毛细管电泳,支持介质的作用,：防止样品中各组分在分离过程中,对流与扩散,，使区带分离清楚。,对支持介质的要求,支持介质应是均匀的,对于分离过程应是化学惰性的，,应便于重复制备。,常用的支持介质,聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，纤维素等都能符合这些要求。,聚丙烯酰胺凝胶广泛应用的原因,孔径的大小可以按分析需要在制备时进行调节；聚丙烯酰胺凝胶是非离子型的，没有,内渗,和吸附。,功率的选择,加于系统的功率过大，将产生过多的热量,还使介质的溶剂过多地挥发。而且温度高,会使某些对温度敏感的物质变性，例如酶可能失去活性。,所加功率过小，电泳时间延长，扩散增加，使分离变坏。,电泳分离的类型,.,聚丙烯酰胺凝胶平板电泳,连续电泳,SDS,电泳,等电聚焦电泳法,毛细管电泳,毛细管区带电泳,(CZE),毛细凝胶电泳,(CGE),胶束毛细管色谱（,MECC,）,亲和毛细管电泳（,ACE,）,毛细管电色谱（,CEC,）,毛细管等电聚焦（,CIEF,）,毛细管等速电泳（,CITP,）,连续电泳法,连续电泳法又称均相电泳法，电泳槽中的与凝胶中的缓冲溶液,PH,值是相等的,.,在这种系统的电泳过程中试液没有浓缩过程，因此试液宜浓，体积宜小。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,用聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（,Polyacrglamide,gel electrophoresis,），,简称,PAGE,。,CH,2,=CH-CO-NH,2,+,CH,2,=CH-CO-NH- CH,2,- NH-CO-,CH =CH,2,丙烯酰胺,(,简称,Acr,),甲撑双丙烯酰胺,(,简称,Bis,),交联剂,聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶的制备,改变丙烯,酰,胺和交联剂的浓度和比例可以调节凝胶网状结构孔径的大小。,一般用,T,表示每,100mL,凝胶溶液中二种单体（,Acr,和,Bis,甲撑双丙烯酰胺,）,的,总浓度,。如凝胶溶液中所含的,Arc,质量为,a,，,所含,Bis,的质量为,b,凝胶中缓冲溶液的体积为,m,，,则,T=(a+b)/m,。,T,值一般在,5,20,之间,T,20,，,凝胶变脆。,决定凝胶孔径大小的主要是二种单体的总浓度,T,，,T,值愈大，孔径愈小。,可根据要分离物质相对分子质量大小，选用不同,T,值的凝胶,LDH,4,LDH,3,LDH,5,LDH,1,LDH,2,1 2 3 4,电泳结果实例,电泳装置,采用,Pharmacia,公司的,SE250,小型夹心式垂直板电泳装置：,制胶装置,制备凝胶板,电泳装置,进行凝胶电泳,操作步骤,一、样品制备：,断脊椎处死小鼠，取适量小鼠,骨骼肌、肝脏、心肌,和,脑,组织，加入,5,倍组织重的匀浆缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆，离心,(10 000 r /min,，,15 min),，,吸出上清液，加入等体积,40 %,的蔗糖（含少许溴酚蓝）混匀，放置,4,冰箱中备用。,二、制备凝胶：,凝胶模的组装,凝胶模由,一块玻璃板,、,一块凹形氧化铝板,和,两条间隔条,组成，将它们按下图组装，四周对齐，注意手指勿接触玻璃和氧化铝板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。,将凝胶模安装在固定架上,将凝胶模插入固定架，,使凹形氧化铝板紧贴固定,架的背板，将固定架放在,一个水平玻璃板上，使凝,胶模各部件与固定架下缘,对齐，轻轻拧紧螺丝，使,压条紧压凝胶模。,背板,压条,固定架,橡胶垫,底座,凸轮,将固定架安装在底座上,将固定架置于凝胶,模底座上，螺丝朝外，,固定架两侧插入凸轮，,凸轮旋转,180,o,使凝胶模,的下缘在固定架的橡胶,垫上压紧，形成一个,密,闭的夹心式凝胶模,。,制胶,(T=7.5%，C=2.6%),按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，立即混匀，沿玻璃板,尽快,倒入玻璃板和金属板缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板（白金属板）上缘,0.3,cm,时，立即轻轻将,样品槽模板,插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，,3060,min,聚合反应完成。,制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方,（两组）,凝胶溶液组成,体积,Tris-Gly,缓冲液,5,mL,30%凝胶贮液,2.5,mL,重蒸水（含,TEMED）,2.,5,mL,10%,AP,60,L,凝胶板,电泳槽本体,三、准备电泳：,将凝胶板安装在电泳槽本体上,将凝胶板从制胶装置上取下，安装到电泳槽本体上，使凹形氧化铝板紧贴在本体的密封橡胶封条上，用弹簧夹夹紧，在凝胶板和本体之间形成一个封闭的上液槽。,加样,取,125mL,电极缓冲液贮液，用去离子水稀释到,250mL,，加入,上、下缓冲液槽中,，,注意上槽液要,高过凹形板,，凝胶板与下液槽的缝隙处无气泡。将印有样品槽模板形状的塑料片贴在玻璃板上，使其与样品槽重合（加样后电泳前将塑料片取下），小心拔出样品槽模板。用微量进样器吸取一定体积的样品溶液，小心地将样品加在样品槽底部。注意,每种样品使用,同一支进样器,，以免样品相互污染。,骨骼肌 8,L,心肌 5,L,肝脏 3,L,脑 10,L,四、电泳：,加样后，盖上电泳,槽安全盖，接通电源，,注意正负电极的连接，,将电泳仪调至恒压,80,V,，,待指示剂全部进入凝胶,后，电压提高到,120,V,，,继续电泳，直到溴酚蓝,前沿到达距凝胶下端约,0.5,cm,时，关闭电源，,停止电泳（本实验可将,溴酚蓝走出,0.5,h1h,后停,止电泳）。,电极导线,安全盖,上液槽,下液槽,橡胶封条,弹簧夹,冷却水口,五、活性染色，脱色，照相：,电泳结束后，将凝胶板取下，用薄尺子轻轻将玻璃板和氧化铝板撬开，在凝胶下部切角标注凝胶方位，然后将带有凝胶的板反扣过来，胶面朝下，用尺子小心地将凝胶的一角剥离，使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，放入,37,恒温水浴中保温，染色过程注意,避光,，待大多数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为,1530,min,。,加入脱色液终止酶促反应，摇动,35,min,，,凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。,显,色（半定量）,DNA,用溴乙,锭、蛋白质用考马斯兰显色,SDS,电泳,前面已经讨论了蛋白质分子在聚丙烯酸胺凝胶中电泳时，它的迁移率决定于蛋白质分子所带的净电荷，以及其大小、形状等因素。如果在聚丙烯酸胺凝胶中加入足够量的阴离子表面活性剂,十二烷基磺酸钠,（,S,odium,d,odecyl,s,ulfate,，,简称,SDS,），,则蛋白质分子的电泳迁移率主要决定于它的相对分子质量，而与它所带的,电荷和形状,无关，因此,SDS,电泳法可用来测定,蛋白质的相对分子质量,。,SDS,的,作用,SDS,能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并与蛋白质分子络合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,络合物。,如果加入的,SDS,足够多，则使各种蛋白质的,SDS,络合物都带上相同数量的负电荷，电荷数量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而就掩盖了不同种类蛋白质分子间原有的电荷差别；,SDS,与蛋白质分子络合后，还引起了蛋白质分子构象的改变。,SDS-,蛋白质组合物在水溶液中的形状为棒状长椭圆形，不同蛋白质分子的,SDS,络合物的短轴长度相同，约为,1,8nm,。,长轴则随蛋白质相对分于质量的不同成比例地变化。,因而,SDS-,蛋白质络合物在聚丙烯酸胺凝胶中电泳时的迁移率，不再受蛋白质分子原有的电荷和形状的影响，仅随蛋白质相对分子质量而变,。,等电聚焦电泳法,等电聚焦电泳法简称,IEF,，,是一种在,pH,梯度介质中进行的电泳方法。带有电荷的蛋白质大分子，在电场作用下将迁移通过,pH,梯度的介质，但当迁移到介质的,pH,值等于这种蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子上的净电荷消失，迁移停止，即“聚焦”于这种,pH,值的介质中。各种蛋白质分子的等电点不同，它们将分别聚焦于不同,pH,值的介质中，从而得到分离。,电泳管中,pH,梯度的建立,在电泳管的正极加入强酸，负极加入强碱，中间加入两性电解质混合物。在电泳开始前电泳管中的,pH,值如左图所示,。,接通电源，开始电泳。两性电解质失去质子而带负电荷，在电场,作用下向正极移动，直至到达该组分的等电点时停止移动。,两性电解质混合物中组分较多，各组分间的等电点相差较小，于是在正、负两极间就形成了一个近乎线性的、连续递增的,PH,梯度。,pH,梯度的建立,pH,梯度是依靠,一系列不同等电点的两性电解质的,混合物而建立的。,为了获得均匀的,pH,梯度，所用两性电解质的性质起很大作用，它应具有,较大的缓冲容量，能控制一定范围内介质,的,PH,值等于它的等电点,在它们的等电点时具有一定的,pH,值；,在等电点时也具有较好的导电性；,分子较小，与大分子的试样组成不同，也不起反应。现在常用的两性电解质商品称,Ampholine,，,是相对分子质量为,300,1000,的,多羧基多氨基脂肪族化合物的混合物,。,不同氨基酸的等电点,电,内渗,问题 电,内渗,是由支持,介质,上的带电荷基团引起的，例如纤维素含有少量羧基，在中性或碱性缓冲溶液中将电离而带负电荷，可吸引介质中的,H+,，于是在其附近就形成带正电荷的水层。这种水层在电场作用下将向负极移动，发生了溶液相对于支持介质的移动。如果被分由物质的迁移方向与之相同，则可加速其泳动，表观速度大于真实速度；反之，则使表观速度小于真实速度。其结果都可使迁移率发生改变。,Capillary Electrophoresis (CE),毛细管电泳,毛细管电泳是指以毛细管为分离室、以高压直流电场为驱动力的一类新型电泳技术,CE involves the application of,high voltages,across buffer filled capillaries to achieve separations,Many of the CE techniques rely on the,electroend-oosmotic,flow (,EOF,) to pump solutes towards the detector,毛细管的特点,毛细管电泳通常使用内径为,100m,或更细的（聚酰亚胺）弹性融熔石英管，标准外径为,375m,。,毛细管的特点,:,容积小（数微升）,侧面与截面积比大因而散热快、,可承受高压电场,可使用自由溶液、凝胶等为支,持介质，在溶液介质下能产生,平面形状的电渗流。,毛细管电泳具有许多突出的优点,分离效率高（,10,5,TP,m,10,7,TP,m,）,分离速度快（几十秒至十分钟）；,分析对象广，小到无机离子大至整个细胞，具“万能”分析功能或潜力。,操作可高度自动化；,样品与试剂消耗量小，运转费用低,无环境污染问题,分离模式多，选择自由度大,电渗与电渗流,电渗是伴随电泳产生的一种电动现象，在,CE,分离中扮演着重要角色,电渗是毛细管中的溶剂因直流电场作用而发生的定向流动的现象。电渗起因于定位电荷。所谓定位电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。定位电荷吸引溶液中的反号电荷，使其聚集在自己周围的溶液中。在电场下，反号电荷发生电泳，同时带动,溶剂分子同向运动,，形成电渗流,(,mm/s,),。,Basic Theory CZE,电渗流,Electroendoosmotic,Flow (EOF),http:/,ntri.tamuk.edu/ce/fsilica.html,硅熔毛细管,Fused silica capillary tube,定位电荷,-,毛细管壁上有硅羟基,Basic Theory ,CZE,电渗流,Electroendoosmotic,Flow (EOF),在高,pH,下,硅羟基的离解在管壁使管壁带负电,.,施加电压时使管内溶液整体从正极流向负极,电渗的方向总是与定位电荷所应有的迁移方向相反；,电渗的强度与定位电荷的数量成正比，与溶剂的量成反比。所以,毛细管越细,，对应的电渗流就越强。,http:/,ntri.tamuk.edu/ce/fsilica.html,电渗流,(,eo,),和电渗淌度,(,eo,),eo,= -,0,W,E/ ,eo,= -,0,W,/,0,真空介电常数,溶液介电常数,W,zeta,电势 荷电粒子有效半径所构成的面上与溶液主体的电势差,E,电场强度,是溶液的粘度,W,= 4,e/ ,-,扩散层厚度, 3,10,-7,Z C,1/2,-1,e,溶液中单位面积的总过剩电荷,(H,+,).,从 ,eo,= -,0,W,E/,计算,W,E=400V/cm, =10,-4,Pa.s ,0,=8.85,10,-12,C,2,N,-1, ,= 80,eo,(,mm/s,),W,(,mV,),0.1 3.1,1 31.7,2 63.5,4 127.0,(1),电场强度,EOF,与电场强度成正比,.,毛细管长度固定时，与外加电压,V,成正比,当外加电压太高（或缓冲溶液浓度太高，毛细管内径过大）时，,EOF,偏离线性这是由于在,此条件下毛细管不能有效地散失产生的焦耳热，导致温度升高，介质粘度变小的结果,.,影响,EOF,的因素,(2),毛细管材料,不同材料的表面电荷特性不同,(3),溶液的,pH,在高,pH,下，表面,Si,OH,基电离，负电荷密度大,.,在低,pH,下，由于,Si,OH,基,质子化作用，负电荷表面被,H,+,中和，直到,pH=4,，,质子化作用的结果使已趋于零所以溶液,pH,对,EOF,有非常显著的影响如图,.,pH- EOF,曲线的形状一般呈,S,形,(4),电解质溶液成分与浓度,对于同一缓冲溶液，,EOF,随浓度（确切说，离子强度）增加而降低这是因为浓度增大，双电层厚度变薄，,zeta,电势下降，,EOF,变小,W,= 4,e/,-,扩散层厚度, 3,10,-7,Z C,1/2,-1,（,5,）添加剂,在电解质溶液中,加入添加剂,，例如中性盐、两性离子、表面活性剂以及有机溶剂等，会引起,EOF,的显著变化加入中性盐可使双,电层厚度变薄,，加入两性离子（如四甲基氯化铵）可,增加溶液粘度，降低,pH,值，这些都,导致,EOF,减小,表面活性剂能显著改变毛细管内壁电荷特性，依加入的种类和浓度不同，可使内壁带负的或正的电荷，或是中性的,添加剂的作用,控制,EOF,的大小,抑制管壁的吸附作用,稳定生物大分子的三级结构,增加疏水溶质的溶解度,扩大分离对象,如添加手性试剂进行手性物质分离,增加溶液粘度,降低电流,优化分离条件,.,常用的,添加剂,表面活性剂,有机溶剂,手性试剂,如冠醚,环糊精,两性离子,其他,如尿素,线性聚丙烯酰胺等,三种烷基链长不同的表面活性剂浓度对,EOF,的影响（,pH 91,）,1,癸烷基三甲基溴化铵,2,十二烷基三甲基溴化铵,3,十四烷基三甲基溴化铵,表面活性剂浓度增大时，,EOF,下降，,长链烷基季胺盐影响更显著，并可使,EOF,反向，由流向阴极变为流向阳极,表面活性剂的浓度要小于,CMC,（,即临界胶束浓度）,当表面活性剂浓度高于,CMC,时，将形成胶束，此时的,CE,就改变为胶束电动毛细管色谱,浓度,mmol,/L,分离原理,EOF,在,CE,中的作用,电渗是伴随电泳产生的一种电动现象，在,CE,分离中扮演着重要角色,多数情况下，,EOF,速度比电泳速度快,5,一,7,倍，因此，,在,CE,中利用,EOF,可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向（如阴极方向）迁移,，在一次,CE,操作中同时完成正、负离子的分离分析,通过,EOF,大小和方向的控制，还可以影响,CE,分离的效率、选择性和分离度，成为优化分离条件的重要参数,分离原理 净迁移,http:/,ntri.tamuk.edu/ce/fsilica.html,净迁移,=,电迁移,+,电渗流迁移,H,合淌度；,H,为合速度。,由于电渗的存在，毛细管电泳可以同时分离正负离子，这和传统电泳不同。,淌度,电泳分离的基础是建立在各分离组分有效淌度的差异上,绝对淌度,ab,绝对淌度是在无限稀释时单位电场强度下离子的平均迁移速度它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数,.,分离效率,CE,中的分离效率用理论塔板数表示，其理论表达来源于色谱理论,.,理论塔板数,n,t,R,保留时间,Y,1/2,半峰宽,H,塔板高度,分离度,R=1,分离程度,98%,R=1.5,分离程度,99.7%,当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。,在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是,:,首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。,区带增宽,CE,分离的基础是溶质电迁移速度的差异电迁移过程中，各种组分区带不仅由于它们的迁移速度不同而被分离，而且亦由于一系列,分散因素,，如扩散等的作用而不断地被增宽为了能对两个淌度相近的物质得到很好的分离，了解和控制可能存在的分散因素，使过程的分散作用最小是至关重要的,从电泳图看,峰宽越窄,分离效率高,分离度大,区带增宽,影响区带增宽的因素,右边各项脚标分别表示扩散、进样、温度、吸附、 电分散、检测和其它等因素引起的区带增宽,扩散增宽,2,Dif,=2D,t,m,D,溶质的扩散系数，,t,m,迁移时间,扩散增宽与溶质在毛细管中迁移时间,t,m,成正比。,迁移时间受许多分离参数影响，如毛细管长度、分离电压、缓冲溶液浓度等,扩散系数是溶质本身的一种物理特性，它随分子量的增加而降低,对球形大分子扩散系数与分子量的立方根成反比,D,i,=,kT,/6,Na,式中,k,为,Boltzmann,常数，,T,为温度，,为溶液粘度，,N,为,Avogadros,数，,a,为分子体积,不同分子量分子的扩散,系,数（水中，,25,）,蛋白质的扩散系数,进样增宽,进样方差与样品塞长度,W,inj,和初始形状有关理想情况下，导入毛细管中的样品应是无限窄的矩形塞样品长度引起的方差表示为,2,inj,=,W,2,inj,/12,如果,2,inj, ,2,Dif,=2D,t,m,进样,增宽会引起理论,塔板,高度,H,增加,对小分子影响大,.,温度增宽,电流通过毛细管内缓冲溶液,时产生焦耳热,焦耳热通过管壁向周围环境散逸时，在毛细管内形成径向温度梯度,管壁温度低于管轴心温度,导致操作缓冲溶液的径向粘度梯度，因而产生,离子迁移速度的径向不均匀分布,导致区带增宽,.,eo,= -,0,W,E/,石英毛细管截面示意图,1,毛细管内腔；,2,石英管壁；,3,聚酰亚胺层,溶质与管壁的相互作用,吸附效应,毛细管表面的硅羟基具有阳离子交换性质，它在,pH,3,的水溶液中离解使表面带负电荷,多数蛋白质（约,75,）的,PI,4,，,在通常操作的,缓冲溶液,pH,下带正电,.,带负电荷的毛细管表面与带正电荷蛋白质间的静电引力作用，产生强烈的吸附效应,除静电引力作用外，还有疏水相互作用,由于吸附，使区带增宽，导致峰拖尾或变形，甚至完全消失,降低毛细管内壁对溶质的吸附的方法,极端,pH,条件,即在低,pH,（,23,）或高,pH,（,9,）,的操作缓冲溶液中进行,CE,分离在低,PH,下，硅羟基离解受到抑制，吸附降低在高,pH,下（,pH,pI,），,蛋白质带负电荷，与管壁相互排斥，吸附受到抑制，但是，,pH,与,pI,差异过大会引起蛋白质结构变化甚至水解,溶液,pH,值对氨基酸蛋白质净电荷的影响,加入中性盐或两性离子化合物,加入中性盐（如,K,2,SO,4,）,或提高缓冲溶液浓度，可以降低表面有效电荷，抑制吸附作用但离子强度增加，导致,EOF,降低，溶质在毛细管中的停留时间加长，而且电流增高，产生过量焦耳热,.,降低外加电压或采用细孔径毛细管可减少焦耳热产生，但又导致柱效降低和样品负载减小，增加检测困难,用两性离子化合物,，,（,CH,3,）,3,N,+,CH,2,CH,2,CH,2,SO,3,-,（,TMAPS),或（,CH,3,）,3,N,+,CH,2,CH,2,CH,2,CH,2,SO,3,-,（,TMABS,）,代替中性盐，能缓解上述矛盾,是抑制蛋白质吸附的有效方法,毛细管内壁涂层,对毛细管内壁进行涂层处理,.,毛细管内壁涂层,一,.,动态吸附技术,在电泳缓冲液中加,两性离子化合物,等物质,.,如前面加的（,CH,3,）,3,N,+,CH,2,CH,2,CH,2,SO,3,-,等,.,二,.,物理涂布,将毛细管内壁洗净,干燥后用纤维素等有机物涂复毛细管内壁,三,.,化学键合,化学键合,主要是涂层物质与管道内壁共价键合，从根本上屏蔽活跃的硅羟基，从而抑制电渗流和吸附现象,CH,3,CH=CHCOO(CH,2,),3,Si(OCH,3,),3,-,甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷,(,-MAPS),CH,3,CH=CHCOO(CH,2,),3,Si(OCH,3,),3,双功能团的硅烷化试剂，这种硅烷化试剂的硅基团与表面硅羟基反应，然后其另一端的双键用来与单体共聚,.2.,引入目标涂层试剂如,:,聚丙烯酰胺涂层的制备,.,毛细管上的双键基团和丙烯酰胺单体发生聚合反应并形成涂层,.,1.,活性基团的引入,毛细管电泳的分离模式与应用,毛细管区带电泳,capillary zone electrophoresis, CZE,毛细管凝胶电泳,capillary gel electrophoresis, CGE,毛细管等速电泳,capillary,isota,-,chophoresis, CITP,毛细管等电聚焦,capillary,isoelectric,focus, CIEF,毛细管区带电泳, 毛细管区带电泳使用均一的、具,pH,缓冲能力的自由溶液为分离介质。这种介质称为电泳缓冲液（,Runing,buffer,），,简称缓冲液，它由缓冲试剂、,pH,调节剂、溶剂和添