基因诊断常用技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因检测常用技术,医学遗传学课程,检测技术的发展,1950s-Rosalind Franklin (1920-1957) discover chemical structure of DNA, starting a new branch of science-molecular biology.,Watson and Crick made a model of the DNA molecule and proved that genes determine heredity.,1957-,Arthur,Kornberg,(1918- ) of the U.S. produced DNA in a test tube.,1966-,The Genetic code was discovered; scientists are now able to predict characteristics by studying DNA. This leads to genetic engineering, genetic counseling.,1972-,Paul Berg (1926- ) of the U.S. produced the first recombinant DNA molecule.,1983-,Dr.,Kary,Mullis discovered the PCR procedure, for which he was awarded the Nobel prize.,2000-,J. Craig,Ventor, along with Francis Collins, jointly announce the sequencing of the entire human genome,基因组,DNA,的基本结构与化学组成,1,核苷酸,=1,磷酸,+1,五碳糖,+1,碱基,核酸分两类,DNA:,碱基,A,G,C,T,RNA:,碱基,A,G,C,U,双螺旋结构,：,是由,2,条平行的多核苷酸围绕同一中心轴构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸二酯键的走向决定，一条从,5 3,，另一条从,3 5,，两条链呈反向平行排列，彼此由氢键相连,，,G,与,C,配对，,A,与,T,配对。,En,promoter,5,E1,GT,AG,1,5UT,3,3UT,人类结构基因包括,4,个区域：编码区：包括外显子、内含子,前导区：编码区上游,尾部区：编码区下游,调控区：包括启动子、增强子等,基因的结构,E2,I,2,转录起始点,终止密码,AATAAA,转录终止点,1,ggggacagcc,agggacaggc,agacatgcag,ccagggctcc,agggcctgga,caggggctgc,61,caggccctgt,gacaggagga,ccccgagccc,ccggcccggg,gaggggccat,ggtgctgcct,121,gtccaacatg,tcagccgagg,tgcggctgag,gcggctccag,cagctggtgt,tggacccggg,181,cttcctgggg,ctggagcccc,tgctcgacct,tctcctgggc,gtccaccagg,agctgggcgc,241,ctccgaactg,gcccaggaca,agtacgtggc,cgacttcttg,cagtgggcgg,agcccatcgt,第一代诊断技术,-,限制性片段长度多态性检测（,RFLP,）,限制性核酸内切酶,:,识别和切割特异,DNA,序列；,限制性位点,镰性,细胞贫血,第一代诊断技术,- Southern,杂交,DNA-DNA,杂交：,Southern,杂交基本步骤,Deletion,第一代诊断技术,- DNA,体外扩增技术,聚合酶链反应,（,PCR,）,PCR,的特点,检材要求低,操作简便,灵敏度高,特异性较好,PCR,的问题,易污染,定量困难,人为因素影响,PCR,技术出现的背景,1955,年发现,DNApolymeraseI,；,70,年代的初期发现具有实验价值及可得性,Klenow,fragment,1971,年,Dr.,Kjell,Kleppe,提出类似基因修复复制的,PCR,原始雏形概念；,1976,年从热泉的细菌,(,Thermus,Aquaticus,),中分离出能耐高温,Taq,polymerase,；,1983,年,Dr.,Kary,B.Mullis,发展出,PCR,技术，,1985,年正式发表了第一篇相关的论文。,1989,年，,PCR,被列为年度的重要科学发明产物。,PCR,反应参数,预变性：,94,下预变性,5-10min,，,使模板,DNA,完全解链。减少非特异性配对的引物与模板复合物形成。,循环中的变性：一般变性温度与时间为,94 1min,。,在变性温度下,双链,DNA,解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。扩增片段,GC,含量的差异是变性温度选定的主要依据，,GC,含量高则应相应提高变性温度，反之亦然，但一般不应低于,90,。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,循环中的复性（退火）：,PCR,的一个,关键参数,，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从,55,到,70,。退火温度一般设定比引物的,Tm,4X,（,C+G,）,+2X,（,A+T,）,或软件计算,低,5,当产物中出现,影响实验,的非可异性扩增带时,以,2,为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。,当多重,PCR,扩增各引物对,Tm,值出现差异时，如何初步确定退火温度？,一是将退火温度设定为比最低的,Tm,低,5,；二是根据较高,Tm,设计的退火温度先进行,5,个循环，然后在根据较低,Tm,设计的退火温度进行剩余的循环。,当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定,PCR,参数？,将退火与延伸两步合并,只用两种温度,(,例如用,60,和,94),完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。,退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度，因此,循环中的延伸：延伸反应通常为,72,接近于,Taq,DNA,聚合酶的最适反应温度,75.,实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为,Taq,DNA,聚合酶的作用温度范围可从,20-85.,延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度,.,在一般反应体系中,Taq,DNA,聚合酶每分钟约可合成,1kb,长的,DNA,。,延伸时间过长会导致产物非特异性增加,.,但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间,(10-30min),的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环次数 ：循环次数主要取决于,DNA,浓度。一般而言,25-30,轮循环已经足够。循环次数过多,会使,PCR,产物中非特异性产物大量增加。,如经,25-30,轮循环扩增后,产物量仍不够 怎么办？,一是增加模板量重新扩增；二是将扩增的,DNA,样品稀释,10,3,-10,5,倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经,60,轮循环后,扩增水平可达,10,9,-10,10,。,扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示,:C,Co(1+P),n,。,其中：,C,为扩增产物量,C0,为起始,DNA,量, P,为增效率, n,为循环次数。,在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为,平台效应,。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应,？,，减少非特异性产物。,PCR,反应体系的组成与作用,引用,分子克隆,3,提供的,PCR,标准反应条件：,模板,1pg-1g,引物,1mol/L,DNA,聚合酶,1,5,单位,Mg,2,1.5mmol/L,dNTPs,200mol/L each,KCl,50,mmol,/L,模 板,模板的质量是,PCR,成功的先决条件，,PCR,失败首先要考虑模板问题。,所需的最佳模板量取决于基因组的大小 ：,100ng,到,1g,的人类基因组,DNA,，,相当于,310,4,到,310,5,个分子，要保证模板中含有一个单拷贝，对于单拷贝基因,这需要,0.1g,的人基因组,DNA,。,E.Coli,10ng-100ng,；,LamadaDNA,0.5ng-5ng,；,PlasmidDNA0.1ng-10ng,。,DNA,样品中有多种污染物会抑制,PCR,，如,SDS,，,在浓度低至,0.01,时就会抑制扩增反应。可以加入一些试剂,如,Tween,Nonid,Trition,之类的反过来抑制,SDS,。,模板量过多则可能增加非特异性产物。,模板,DNA,提取的方法较多，如酚,-,氯仿、盐析及,固相吸附洗脱,等。,引 物,引物合成后通常以干粉形式运输，使用前需用,TE,或去离子水溶解，使其最终浓度为,25-100M,，,以前者为佳，因为水的,pH,经常偏酸，会引起寡核苷的水解。,为保证引物的稳定性，应将干粉和溶解的引物储存在,-20,。以大于,10M,浓度溶于,TE,的引物在,-20,可以稳定保存,6,个月，但在室温（,15,到,30,）仅能保存不到,1,周。干粉引物可以在,-20,保存至少,1,年，在室温（,15,到,30,）最多可以保存,2,个月。,引物的浓度会影响特异性 ，最佳的引物浓度一般在,0.1,到,0.5M,。,较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。,引物合成量一般以,OD,值为单位，如,PCR,工作量较小，如仅仅需要,50-150,个反应，只需订购,1OD,的引物，如超过,200,个反应，引物量应不少于,2 OD,。,DNA,聚合酶,考虑两个主要问题：成本与忠实性。,最常用的是,Taq,DNA,聚合酶，但因为其缺少,3,到,5,外切核酸酶（校正）活性，被看做是低忠实性的聚合酶。,带有,3,到,5,外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实度，但价格昂贵，且大多无,3,端加,A,尾能力，不利于,TA,克隆。另外，一些高保真酶的效率要远远低于,Taq,polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些,.,反应体系中酶浓度过高会引起大量的非特异扩增，在常规,PCR,中一般控制在,1-2U,。,Mg2,镁离子浓度与酶活性密切相关。,Mg,离子的作用主要是,dNTP,-Mg,与核酸骨架相互作用并能影响,Polymerase,的活性，因此要记住的是在调整了,dNTPs,的浓度后要相应的调整,Mg,离子的浓度。,一般的情况下,Mg,的浓度在,0.5-5mM,之间调整，,200M,dNTP,的典型,PCR,起始浓度是,1.5mM,，,在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。镁离子浓度过低则会明显降低,PCR,扩增效率。,为了确定最佳浓度,可以用,0.1-5mmol/L,的递增浓度的,Mg2+,进行预实验,选出最适的,Mg2+,浓度。,在,PCR,反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或,EDTA,等可能影响,Mg2+,离子浓度的物质,以保证最适,Mg2+,浓度。,dNTPs,常规,PCR,扩增中,dNTPs,浓度是比较稳定的，变化较小，如每种,dNTP,的浓度为,200M,，,高浓度的会对扩增反应起抑制作用。,如何提高,PCR,扩增特异性？,TouchDown,PCR,：在,PCR,的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的,Tm,高大约,5,的退火温度下开始，然后每个循环降低,1,到,2,（当然，也可以每几个循环降,1,2,），直到退火温度低于,Tm 5,。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,94 5min/,2cycles,（,94 30s,，,60 30s,，,72 1min,）,/,2cycles,（,94 30s,，,59 30s,，,72 1min,）,/,20cycles,（,94 30s,，,55 30s,，,72 1min,）,/,72 5-10min/4,保温,热启动,：聚合酶在室温仍然有活性，在进行,PCR,反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。方法一是在冰上配制,PCR,反应液，并将其置于预热的,PCR,仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。二是使用蜡防护层将将反应成分物理地隔离开，在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。还有一种方法是使用抗体抑制失活的,inactiveDNAPolymerase.,当变性温度超过,70,度时，抗体也变性了，这样,polymerase,又被激活了。,ampliwax,PCRGems(,Perkin,Elmer),Taq,BeadHotStartPolymerase(,Promega,),Magnesiumwaxbeads(,Stratagene,).,PCR,增强剂,：某些模板，尤其是高,GC,含量的模板，添加影响,DNA,熔解温度的增强剂可以提高产物特异性和产量。包括甲酰胺，,DMSO,，,甘油，甜菜碱以及,PCRx,Enhancer Solution,可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助,DNA,聚合酶延伸通过二级结构区。但为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制,Taq,DNA,聚合酶的,DMSO,，,甲酰胺和甘油。,dimethyl,sulfoxide(DMSO,)upto10%,formamide,at5%,trimethylammonium,chloride10-100uM,detergentssuchas,Tween,200.1-2.5%,polyethyleneglycol(PEG)60005-15%,glycerol10-15%,singlestrandedDNAbindingproteins,Gene32protein1nM,E.coli,single-strandedDNAbindingprotein5uM,7,deaza-dGTP(for,GCrich)150uMwith50uM,dGTP,Taq,Extender(,stratagene,),PerfectMatchPCR,Enhancer(stratagene,),Q-,solution(Qiagen,),巢式,PCR,：,使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是,15,到,20,个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释,100,到,1000,倍加入到第二轮扩增中进行,15,到,20,个循环。,PCR,反应可能出现的问题及解决办法,不出现预想的扩增条带 ：,模板：模板中含有,Taq,酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。,酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时,PCR,时忘了加,Taq,酶或电泳时忘了加溴化乙锭。,引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是,PCR,失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看,OD,值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做,PCR,有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。,Mg2+,浓度：,Mg2+,离子浓度对,PCR,扩增效率影响很大，浓度过高可降低,PCR,扩增的特异性，浓度过低则影响,PCR,扩增产量甚至使,PCR,扩增失败而不出扩增条带。,反应体积的改变：通常进行,PCR,扩增采用的体积为,20l,、,30l,、,50l,或,100l,，,应用多大体积进行,PCR,扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如,20l,后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。,物理原因：温度对,PCR,扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低,PCR,扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下,PCR,仪内的变性、退火和延伸温度，这也是,PCR,失败的原因之一。,靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其,PCR,扩增是不会成功的。,出现假阳性扩增：,引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行,PCR,扩增时，扩增出的,PCR,产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。,靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出,PCR,产物，而导致假阳性的产生，可用巢式,PCR,方法来减轻或消除。,出现非特异性扩增带：,PCR,扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是,Mg2+,离子浓度过高、退火温度过低，及,PCR,循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时，重新设计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法,(93,变性，,65,左右退火与延伸，也叫两步法,),。,出现片状拖带或涂抹带：,PCR,扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，,dNTP,浓度过高，,Mg2+,浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶的量，或调换另一来源的酶。减少,dNTP,的浓度。适当降低,Mg2+,浓度。增加模板量，减少循环次数。,PCR,污染及解决对策,污染的预防：,划分操作区：目前，普通,PCR,尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，,PCR,的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：,1.,标本处理区，包括扩增摸板的制备；,PCR,扩增区，包括反应液的配制和,PCR,扩增；,3.,产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备,PCR,扩增产物分析产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。,分装试剂：,PCR,扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的,DNA,和其他来源的,DNA,，,1,PCR,用水应为高压的双蒸水；,2,引物和,dNTP,用高压的双蒸水在无,PCR,扩增产物区配制；,3,引物和,dNTP,应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。,实验操作注意事项 ：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。,戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；,使用一次性吸头，严禁与,PCR,产物分析室的吸头混用， 吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；,避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；,操作多份样品时，制备反应混合液，先将,dNTP,、,缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；,最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；,操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证,PCR,反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；,尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本,DNA,的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少,PCR,操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是,PCR,产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；,重复实验，验证结果，慎下结论。,追踪污染源,设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，,100,个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为,PCR,敏感性极高，可以从其它方法（,Sourthern,印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括,PCR,体系中各试剂的时机对照，即包括,PCR,反应所需的全部成分，而不加模板,DNA,，,这对监测试剂中,PCR,产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。,环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。,1.,模板提取时真空抽干装置；,2.,凝胶电泳加样器；,3.,电泳装置；,4.,紫外分析仪；,5.,切胶用刀或手术刀片；,6.,离心机；,7.,冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。,1,）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；,2,）,0.1ml,去离子水浸泡；,3,）取,5ml,做,PCR,实验；,4,）电泳检测结果。,8.,气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中,PCR,产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。,污染处理,环境污染：,1.,稀酸处理法：对可疑器具用,1mol/L,盐酸擦拭或浸泡，使残余,DNA,脱嘌呤；,2.,紫外照射（,UV,）,法：紫外波长（,nm,）,一般选择,254/300nm,，,照射,30min,即可。需要注意的是，选择,UV,作为消除残留,PCR,产物污染时，要考虑,PCR,产物的长度与产物序列中碱基的分布，,UV,照射仅对,500bp,以上长片段有效，对短片段效果不大。,UV,照射时，,PCR,产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是,DNA,链中所有嘧啶均能形成二聚体，且,UV,照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于,UV,波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长,DNA,链上，形成二聚体缺陷的数量少于,0.065/,碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，,DNA,链间与链内的交联和,DNA,断裂等）均可终止,Taq,DNA,聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（,0.13/,碱基）在,DNA,分子上随机分布，一个,500bp,片段的,DNA,分子链上将有,32,处损伤位点，那么，,105,个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果,100bp,的片段，每条链上仅有,6,处损伤，,105,个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是,UV,照射有一定的片段长度限制的原因。,反应液污染：,1.,DNase,I,法：,PCR,混合液（未加模板和,Taq,聚合酶）加入,0.5U,DNase,I,，,室温反应,30min,后加热灭活，然后加入模板和,Taq,聚合酶进行正常,PCR,扩增。该方法的优点是不需要知道污染,DNA,的序列；,2.,内切酶法：选择识别,4,个碱基的内切酶（如,Msp,I,和,Taq,I,等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用,1h,后加热灭活进行,PCR,；,紫外照射法：未加模板和,Taq,聚合酶的,PCR,混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述,UV,照射法；,g,射线辐射法：,1.5kGy,的辐射可完全破坏,0.1ng,基因组,DNA,，,2.0,kGy,可破坏,104,拷贝的质粒分子，,4.0,kGy,仍不影响,PCR,，,但高于此限度会使,PCR,扩增效率下降。引物可受照射而不影响,PCR,，,g,射线是通过水的离子化产生自由基来破坏,DNA,的。,尿嘧啶糖苷酶（,UNG,）,法：,原理：在,PCR,产物或引物中用,dU,代替,dT,。,这种,dU,化的,PCR,产物与,UNG,一起孵育，因,UDG,可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的,N-,糖基键，可除去,dU,而阻止,TaqDNA,聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。,UNG,对不含,dU,的模板无任何影响。,UNG,可从单或双链,DNA,中消除尿嘧啶，而对,RNA,中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。,dUTP,法：用,dUTP,代替,dTTP,，,使产物中掺入大量,dU,。,在再次进行,PCR,扩增前，用,UNG,处理,PCR,混合液即可消除,PCR,产物的残留污染。由于,UNG,在,PCR,循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含,dU,的新的,PCR,产物。,dU,引物法：合成引物时以,dU,代,dT,，,这样,PCR,产物中仅,5,端带,dU,。,UNG,处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（,1-2kb,以上）的扩增用,dUTP,法效率较用,dTTP,低，而用,dU,法就可克服这一缺点。,dU,引物最好将,dU,设计在,3,端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。,优点：可以去除任何来源的污染；,UNG,处理可以和,PCR,扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量,dU,存在，可彻底消除污染源。,固相捕获法,用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：,1,）用一生物素标记的单链,RNA,探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；,2,）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；,3,）洗脱靶分子后用特异引物扩增非,RNA,探针杂交区域。第,2,）步的漂洗后可用,PCR,检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。,RS-PCR,法（,RNA-specificPCR,）,也称为链特异性,PCR,，,主要指用于,RNA,模板的特异性,PCR,法，该法可明显降低假阳性而不影响,PCR,的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的,3,端（,A,区）有,20,个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，,5,端,20,个核苷酸（,C,区）为附加修饰碱基。与,mRNA,逆转录后，经超速离心使,cDNA,与多余引物分开，再用和第二引物（,C,）,以第一链,cDNA,为模板合成第二链,cDNA,，,以后的,PCR,循环中用逆转录引物的,B,区和引物,C,进行扩增加尾,cDNA,，,而污染的,DNA,或质粒,DNA,才不会被扩增。,抗污染引物法,该对引物扩增时通过病毒,DNA,克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒,DNA,才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。,PCR,引物设计的原则和要点,基本原则,引物与模板的序列要紧密互补,引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,引物不能在模板的非目的位点引发,DNA,聚合反应,(,即错配,),具体原则,引物的长度一般为,15-30,bp,，,常用的是,18-27,bp,，,但不应大于,38,，因为过长会导致其延伸温度大于,74,，不适于,Taq,DNA,聚合酶进行反应。,引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是,3,端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物,3,端出现,3,个以上的连续碱基，如,GGG,或,CCC,，,也会使错误引发机率增加,引物,3,端的末位碱基对,Taq,酶的,DNA,合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为,A,的错配效率明显高于其他,3,个碱基，因此应当避免在引物的,3,端使用碱基,A,。,另外，引物二聚体或发夹结构（包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等）也可能导致,PCR,反应失败。,5,端序列对,PCR,影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。避免,3,末端富含,GC,。,设计引物时保证在最后,5,个核苷中含有,3,个,A,或,T,引物序列的,GC,含量一般为,40-60%,，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物,GC,含量不能相差太大,引物所对应模板位置序列的,Tm,值在,72,左右可使复性条件最佳。,Tm,值的计算有多种方法，如按公式,Tm,4(G+C),2(A+T),，在,Oligo,软件中使用的是最邻近法,(the nearest neighbor method),G,值是指,DNA,双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用,3,端,G,值较低（绝对值不超过,9,），而,5,端和中间,G,值相对较高的引物，因此设计,5,端和中间区为,G,或,C,的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。引物的,3,端的,G,值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发,DNA,聚合反应,引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过,4.5kcal/mol,）,易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使,PCR,反应不能正常进行。引物的,3,末端形成的二聚体，应控制其,G,大于,-5.0kcal/mol,或少于三个连续的碱基互补,对引物的修饰一般是在,5,端增加酶切位点，当在引物,5,端添加酶切位点时要考虑：,a),该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。,b),如果打算,PCR,后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用,TA,克隆的方式连接到质粒上，这时要注意,Taq,酶的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物,5,端而不影响特异性。当计算引物,Tm,值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。,一般说来，引物,5,端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行,4,到,5,个扩增循环；然后在假定引物,5,端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。,若在,cDNA,序列内找寻,PCR,引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在,mRNA,的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像,3,末端非编码区域与许多其他,mRNA,有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使,RNA,特异的,PCR,产物与从污染,DNA,中产生的产物在大小上相区别。,PCR,产物长度对扩增效率有影响。若目的是建立测定特异,DNA,片段的临床检验方法，,120,300bp,的小,DNA,扩增产物可能是最好的。通过定量的,RNA-PCR,检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在,250,750bp,范围内。,各种碱基符号：在设计简并引物或测序时你可能会碰到这样的符号来表示碱基：,B = C or G or T,D = A or G or T,H = A or C or T,K = G or T,M = A or C,N = A or C or G or T,R = A or G,S = C or G,V = A or C or G,W = A or T,Y = C or T,探针的设计,探针的长短一般在,20-50,核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。,注意,G,和,C,的含量努力控制在,40-60,，同时一种碱基连续重复不超过,4,个，以免非特异性杂交产生。,探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。,如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在,70%,以下。,如何获得特定核酸片段引物序列,公开发表且,IF,较高的文献中直接引用：好处在于这些引物序列已经过实验验证。但务必在合成引物前在数据库中核对引物序列，以免印刷或笔误造成不必要的损失。（如,http:/www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST,）,在数据库中查询到现成的引物序列：这些引物序列是研究者实验后上传数据库的，其可靠性好于文献中引物资料。（如,http:/gdbwww.gdb.org,）,引物设计软件自动生成所需引物序列：这是目前较为常用的办法，但仍需设计者具有一定的引物设计知识，能从软件所提供的众多选择中找到合适的引物序列。（如,Primer Premier 5.0,）,手工设计：在不具备相当的引物设计经验前提下，不提倡自己设计引物。,第一代诊断技术,-,单链构象多态性,PCR-SSCP,：,未知基因突变检测（,300bp,片段）,复合技术,PCR-RFLP,RFLP-Southern,PCR-SSCP,PCR-DHPLC,PCR-Sequencing,第二代诊断技术,-,Taqman,技术,Real-time PCR for quantification,基因表达定量研究中的几个基本概念,基因组,DNA,、 总,RNA,、,mRNA,、,cDNA,阴性对照、阳性对照、内对照、标准品,看家基因,第二代诊断技术,-DNA,测序,DNA Sequencing,：,未知基因突变检测（,600bp,片段）,第二代诊断技术,-,变性高效液相色谱,dHPLC,：,未知基因突变检测,第二代诊断技术,-,毛细管电泳,动态突变检测：短重复序列,第二代诊断技术,-,多重连接依赖性探针扩增技术,MLPA,：,基因缺失检测,预计第三代诊断技术,-,基因芯片技术,Gene Chips:,未知基因突变检测,预计第三代诊断技术,-,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法,MALDI-TOF MS,：,未知基因突变检测,技术的进步提升基因诊断的阳性率；,技术的进步提升基因诊断的可靠性；,技术的进步提升基因诊断的有效范围。,