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单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,临床检验基础,临床检验基础是采用各种实验室检查方法和技术，对来自机体的血液、尿液、粪便以及分泌物和排泄物等标本进行一般性状观察，理学、化学、免疫学、病原学和显微镜等检查，为疾病筛查和诊断提供简便、快速的检测结果。,第一节概述,血液,生理概要,标本采集、送检、保存与处理,标本抗凝,血涂片的制备,血细胞染色方法,血细胞显微镜计数法,教学目标,掌握：,血液标本采集的方法及评价，抗凝剂的选择应用，血涂片制备方法和染色原理,，血细胞显微镜计数方法,。,熟悉：,血液,生理,概述和,标本保存,。,一 血液生理概要,1.血液的组成,血浆：血液加抗凝剂后分离出来的液体部分。,血清：血液离休后自然凝固分离出来的液体。,45%,血尘,55%,89%,9192%,2.血液的理化性质,血量：正常人血液量7010ml/kg体重，成人45L，,占体重的6%8%。,颜色：动脉血鲜红色 HbO,2,静脉血暗红色 Hbred,贫血病人 红色变浅,CO、氰化物中毒 樱红色,红细胞悬浮稳定性 唾液酸根形成Zeta电位,黏滞性 血细胞比容 （红细胞数量）,血浆粘度 （血浆蛋白浓度）,比密 血液比密与红细胞相关,男1.0551.063 女1.0511.060,血浆比密与血浆蛋白相关 1.0251.030,渗透压 血浆渗透压 290310mOsm/（kg,H,2,O）,PH 7.357.45,凝固性 凝血因子激活,3.血液的功能,运输功能,协调功能,维持内环境的稳定,防御功能,二、血标本的采集,、,送检、保存与处理,（一）血标本的采集,采血,静脉采血,毛细血管采血,普通采血法,真空采血法,静 脉 采 血 法,(venipuncture for blood collection),凡需血量较多的检查0.5ml,如：ESR、Hct、凝血因子的测定等,。,部位 浅表静脉均可,常用肘部静脉，不明显时可用手背、踝部， 幼儿可用颈外静脉。,体位 坐位或卧位,捆扎时间 1min,二、静脉采血法,【采血方法】,准备选择静脉消毒扎压脉带穿刺、松压脉带抽血拔针止血注入试管。,如以下,视频,所示,静脉采血法,普通采血法,1.避免溶血,器具干燥,避免气泡,2.先拔针头,再缓缓注入试管,3.与抗凝剂混匀时轻轻颠倒,4.严格消毒,5.抽血时只能外抽不能内推,真空采血法（40年代，美国BD公司）,套筒式和头皮静脉式两种,优点：,血样无需容器之间的转移，减少溶血现象，保持,血液标本的完整性，使检验结果更加准确，也有,利于防止医院内血源性传染病的交叉感染和环境,保护。,缺点：,真空采血管价格较高,注意: 采血后,先拔下刺塞针端的采血试管,后拔穿刺针。,I.采血针,2008-10-21,II.持针器,2008-10-21,2008-10-21,III.真空采血管,2008-10-21,血,量0.1ml的检验项目：RBC计数、WBC计数、,BP,C,计数、Hb测定等,毛细血管采血法,Skin puncture for blood collection,采血部位,WHO推荐采取,毛细血管,血以左手中指或无名指指尖内侧,为宜,1手指采血：,优点：方便获较多血量检查结果比较恒定,缺点：与静脉血仍在某些差异。,2耳垂采血：,优点：痛感轻 方便 适用于反复采集,缺点：血循环差受气温影响大检查结果不恒定,RBC、WBC、Hb、Hct结果均比静脉血高，特别是冬季。,3、其他部位：,拇指、拇趾或足,底外侧缘,采血 半岁以下婴幼儿,皮肤完整处 严重烧伤者,采血针,三棱针或专用的“采血针”为好，使用前者应高压灭菌，,一人一针,。,2008-10-21,注意事项,1、采血部位皮肤完整。,2、无菌技术操作：防采血部位感染，,一人一针防肝炎、艾滋病。,3、采血针刺入皮肤应深浅适中。,4、多项检查时，采血次序为：BP,C,计数RBC计数、Hb,测,定,WBC计数与分类。,5、取血用于自动化血细胞分析仪，要防止棉球纤维混入,堵塞仪器。,两种采血方法的优缺点比较,毛细血管,采血,静脉采血,缺点,限制了重复实验和追,加实验，标本量少，,局部炎症可得假结果,，组织液可混入,不同抗凝剂的使用，,改变血液性质，影响,有形成分的形态,优点,价廉、快速、操作简,便，标本可直接测定,标本代表性大，无组,织液影响，适于临床,研究，可重复实验和,追加其他实验,1.,血标本运输,2.血标本保存,3.检验后标本处理,（二）,血液标本运输、保存与处理,三、血标本的抗凝,1、枸橼酸钠（柠檬酸钠）,a. 抗凝原理：螯合钙离,子,使用方法 配成 109 mmol/L的浓度和血液1：9,配成 10,5,mmol/L的浓度和血液,1：4,化学名：3-羟基-3-羧基戊二酸（三钠盐）,c. 适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）,d. 不适用于：血细胞计数,2,. 乙二胺四乙酸（EDTA）盐,a. 抗凝原理： 螯合钙离子,b. 使用方法： 15g/L浓度EDTA 和血液 1：10,适用范围： 对血细胞形态影响小,适合血常规检查、 Hct,不适用于：影响血小板聚集和,凝血因子,功能,不宜凝血,因子,检查和血小板功能试验。,3,. 肝素,（含硫酸基团的粘多糖）,抗凝原理：低浓度时抑制因子a、和PF,3,之,间的作用，加强抗凝血酶灭活丝,氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，,还能抑制凝血酶的自我催化及抑制,因子的作用；高浓度时阻断凝血,酶和纤维蛋白的反应。,b. 适用方法： 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10,优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易,溶血、能耐高温。,适用范围：红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白,测定、红细胞比积）和多种生化分析,e. 不适用于：,WBC和BP,C,计数、血涂片检查、,凝血,功能,检验。,4,. 草酸钠（乙二酸的钠盐）,a. 抗凝原理：草酸钙沉淀,b. 使用方法： 草酸钠 0.1mol/L 和血液1：9,c. 适用范围： 止血学检验 。,d. 不适用于：对凝血因子V保护功能差，,影响PT测定；沉淀物影响,自动凝血仪的使用,。,5,. 双草酸盐抗凝剂,a. 抗凝原理： 草酸钙沉淀,使用方法： 草酸钾0.8g , 草酸铵1.2g（100ml）,与血液 1：10 （80,C,以下烘干）,适用范围： 红细胞检验（红细胞比积、计数）,d. 不适于: 血小板计数和白细胞分类计数, 电解质测定,物理方法抗凝,脱纤维蛋白：,将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，,纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，,使血液,不能凝固,。适用于免疫学检验和红斑,性狼疮细胞检查。,小结,血液是由血细胞和血浆组成的红色、粘稠、不透明、带腥味的混悬液。凡需血液量较少的检验项目，常用皮肤采血法，通常采手指血。采血时要注意采血部位要无病变，要擦去第一滴血，不能用力挤压。凡需血液量较多的检验项目，要用静脉采血法，其采血部位常用肘前静脉。如需要抗凝抗凝血标本时，则需要根据检验项目的要求，采用枸橼酸钠、乙二胺四乙酸盐和肝素等抗凝剂来阻止血液凝固。,请您练习,答案:,皮肤采血法用注意什么问题?,所选择采血部位的皮肤应完好。,严格消毒皮肤，防止采血部位感染。,皮肤消毒后，待乙醇挥发干后再刺针。,如血流不畅，切不可用力挤压勉强采血，而应重新针刺。,出血不止时，可用消毒干棉球压迫至血不再流出为止，必要时应在报告单上注明，提醒临床医生注意。进行多项细胞检查要分项采血时，采血的次序为：血小板计数、红细胞计数、白细胞计数。,请您练习,请说出静脉采血的步骤？,答案:,准备,选择静脉,消毒,扎压脉带,穿刺、松压脉带,抽血,拔针止血,注入试管。,请您练习,答案:,请说出枸橼酸钠的抗凝原理、用途及其用量？,枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物，使,Ca,2+,失去凝血作用，从而阻止血液凝固。,主要用于血沉、凝血象和血小板功能检查。凝血象检查常用0.109mol/L的水溶液，与血液之比通常为1：9。魏氏法血沉测定用浓度为0.105mol/L，与血液比例为1:4（V：V）。,请您练习,请将下列抗凝方法和适宜的项目用线连接起来。,枸橼酸钠 血细胞比容测定,乙二胺四乙酸盐,红斑狼疮细胞的检验,肝素,凝血象,脱纤维法 一般血液学检查,教学,目标,1.叙述载玻片的清洁方法、血涂片的制备方法及合格血片的标准。,2.阐述瑞氏染色的原理、染液成分、染色方法、注意事项和染色结果的判断。,3.知道吉姆萨染色法和混合染色法。,良好血涂片的标准,厚薄适宜, 头体尾分明，,细胞分布均匀,血膜边缘整齐,两侧两端留有空隙,良好血涂片,尾,体,头,四 血涂片的制备,血涂片染色显微镜检查用途：细胞形态检查，细胞,数量评估，,网织红、异常细胞、寄生虫检验。,血膜过厚：细胞重叠缩小,血膜过薄：细胞分布不匀，白细胞多集中于边缘,1.,玻片清洁：,a,新玻片处理：,用盐酸浸泡24小时,。,b,用过玻片处理：,用洗涤剂清洗。,c,使用中玻片处理：只能持玻片边缘，,保持清洁、干燥、,中性、无油腻。,操 作,推片,载玻片,25-30 ,30,-,45,血液,推玻片,载玻片,制备过程：,角度大,角度大 速度快 血膜厚,血滴过大,血膜过厚,造成血膜厚的原因示意图,造成血膜薄的原因示意图,角度小,血滴小 血膜薄,角度小 速度慢 血膜薄, 25,血膜分布不均：主要由于以下原因所致:,推片用力不均,血膜成厚薄相间的梯形,玻片不清洁 有油迹,血膜出现空泡区,推片边缘不齐,血膜出现线条样缺损,碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核,的染料。如亚甲蓝、天青。,酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧,烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合,细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、,嗜酸性颗粒成分等。,3. 复合染料： 同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,（一）染料 （天然染料和人工染料）,发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染 组织亲合。,五 细胞常用的染色方法,（二）细胞染色原理：,1. 物理作用：,毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等,化学作用：,a. 染料的化学成分：,助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与,组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在,溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。,瑞氏染色法,（一）染色原理,分两相进行，第一相是酸性伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒结合；碱性,亚甲蓝,与细胞中的酸性物质如核染色质、,嗜碱,性颗粒、血小板结合。第二相是,亚甲蓝,和伊红结合在适宜条件下形成紫色的,亚甲蓝,-伊红复合物，结果使白细胞核染色质成紫色（疟原虫的染色质成红色），中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区成紫色。,b. 蛋白质的化学性质：,蛋白质中的氨基酸含有不同 数量的氨基（-NH,2,）和,羧基（-COOH），同时还有其他活性基团。在游离状态时，,-NH,2,获得一个H,+,变成带正电的-NH,3,+,，而-COOH失去一个H,+,变成带负电的-COO,-,。分别与不同染料结合。,c. 周围环境的酸碱度：,如环境pHpI（ pI 为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性,染料；反之， pH pI，则结合碱性染料。,PHH增多易与伊红结合染色偏红,PHH减少易与美蓝结合偏蓝,（二）试剂,1. Wright染液 瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml,磷酸盐缓冲液（PBS）：,（PH6.46.8）,磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g,蒸馏水加到1000ml。,配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,1,2,3,3. 染色方法：,a. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。,b. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。,c. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10,分钟。,d. 用清水冲洗，待干后镜检。,注意事项：,a. 血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落,b. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，,一般染液淡、染色时间长些效果好。,c. 染液不能过少，以防蒸发沉淀。,d. 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料,沉着。冲洗时间也不能长。,e. 染色过淡，可复染。,f. 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色,姬姆萨染色法,（一）染色原理： 基本成分仍然是伊红和亚甲蓝，改 进了染料的质量，使细胞核着色好，结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒染色较差。,（二）试剂 Giemsa 甲醇 纯甘油,（三）染色方法,1. 甲醇固定干燥血膜3-5min,2. 将血膜在染液中浸染10-30min,3. 流水冲洗,待干后镜检,瑞氏吉姆萨复合染色法,优点：细胞核与细胞质均着色良好,六 血细胞显微镜计数法,原理：将待测标本经过适当稀释（或浓缩），有时还需将标本进行染色后，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的细胞，再换算成每升标本内的细胞数。,优点：操作简便、设备简单、价廉,缺点：影响因素多、费时、费力,质量控制：,计数误差：采血部分不准、稀释倍数不准、充液不,当、血液凝固、误认、充液有气泡等,固有误差：计数域误差（细胞分布不均）,仪器误差（仪器不精密）,
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