SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量,1,【目的】,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。,掌握垂直板电泳的操作方法。,运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,2,【原理】,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物，由于复合物分子量的不同，在电泳中反应出不同的迁移率。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。,3,在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），形成蛋白质SDS复合物，这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的,电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,4,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,5,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,6,当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的自然对数值呈反比，符合下列方程：,lnM,r,=bm,R,+K,式中：M,r,为蛋白质分子量，m,R,为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b 和K均为常数。,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条,标准曲线,。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,7,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量,。,相对迁移率,8,【实验器材】,直流稳压电泳仪,垂直平板电泳槽,移液器,微量注射器,烧杯、试管、滴管、培养皿、直尺等,9,10,11,12,13,【实验试剂】,凝胶贮备液,分离胶缓冲液,浓,缩胶缓冲液,10%SDS,2,倍还原缓冲液,14,【实验试剂】,电极缓冲液,10%,过硫酸铵,染色液,脱色液,15,【实验试剂】,低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶,B,Mr,=97,400,牛血清白蛋白,Mr,=66,200,兔肌动蛋白,Mr,=43,000,牛碳酸酐酶,Mr,=31,000,胰蛋白酶抑制剂,Mr,=20,100,鸡蛋清溶菌酶,Mr,=14,400,16,一、装板,将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个“夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液。,【操作方法】,17,二、分离胶的配制（12%）,试剂,体积,H,2,O,3.35（ml）,凝胶贮备液,2.5（ml）,分离胶缓冲液(pH8.8),2.5（ml）,10% SDS,0.1（ml）,TEMED,5（ul）,10%过硫酸铵,50（ul）,总体积,10（ml）,18,三、分离胶的灌注和聚合,用移液管将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。,19,四、浓缩胶的配制（5%）,试剂,体积,H,2,O,2.92（ml）,凝胶贮备液,0.8（ml）,分离胶缓冲液(pH6.8),1.25（ml）,10% SDS,0.05（ml）,TEMED,5（ul）,10%过硫酸铵,25（ul）,总体积,5.05（ml）,20,五、浓缩胶的灌注和聚合,用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。,21,六、样品的准备,在低分子量标准蛋白质和待测样品中分别加入适量还原缓冲液，放入沸水浴中加热35min，取出冷至室温。,22,七、加样,加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加入Marker。,加样,样品迁移方向,23,八、电泳,上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电压控制在不高于100V，样品进入分离胶后，电压控制在不高于140V。待指示剂染料靠迁移至下沿11.5cm处停止电泳。,24,九、染色和脱色,小心将胶取出，放入一大培养皿中。,染色：,加入染色液，置于摇床上染色2h。,脱色：,染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰，拍照。,25,十、相对分子质量的计算,量出分离胶顶端距溴酚蓝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与分离胶顶端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率m,R,:,相对迁移率m,R,=,以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。,蛋白质样品距分离胶顶端迁移距离(cm),溴酚蓝区带中心距分离胶顶端距离(cm),26,思考题,在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后，需在其上加一层水，为什么?,电极缓冲液中甘氨酸的作用?,在不连续体系SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，试述其作用?,样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,27,