微生物学基本操作技术

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，,2012,大家好,内 容,微生物分类,微生物接种和培养,微生物的分离,微生物的鉴定,微生物保藏,质控微生物,一、微生物分类,一、微生物分类,-,微生物的进化和多样性,普遍性系统发育树,亲缘关系根据,rRNA,序列比较来决定。,G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,1993,一、微生物分类,原核生物,大小,: 0.5-3,m,m,形状,:,-,球型,(,Sthaphylococcus),-,棒状,(,Escherichia coli,),-,螺旋,(,Rhodospirillum,),生长迅速，,20min,至几小时可繁殖一代,可利用多种碳源,真核生物,细胞器：,线粒体,内质网,高尔基体,液泡,一、微生物分类,http:/micro.magnet.fsu.edu/cells/animals/images/animalcell.jpg,http:/www.microscopy.fsu.edu/cells/procaryotes/images/,procaryote.jpg,原核生物,一、微生物分类,真核生物,一、微生物分类,一、微生物分类,-,多相分类,表征（表型）特征,形态特征,生理和代谢特征,生态特征,遗传（基因型）特征,蛋白质比较,核酸碱基组成,核酸序列,多相分类,Polyphasic Texonomy,Technology,一、微生物分类,-,微生物的分类等级,“,种,”,是微生物分类中最基本的分类单元。,“,种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似,G+C,组成并通过,DNA,杂交试验判断由,70%,或更大相似性的菌株的集合。,分类等级,界（,Domain,）,门（,Phylum,）,纲（,Class,）,目（,Order,）,科（,Family,）,属（,Genus,）,种（,Species,）,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,微生物接种定义,将微生物的纯种或含菌材料（如水、食品、空气、土壤、排泄物等）转移到培养基上，这个操作过程叫微生物的接种。,接种工具,微生物接种技术分类,斜面接种,液体接种,穿刺接种,平板接种,二、微生物接种和培养,斜面接种,左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平；,右手先将棉塞（硅胶塞）拧转松动，再拿接种环；,用右手的小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上灼烧；,接种环灼烧灭菌后插入试管内，冷却、挑菌，转入另一斜面底部，沿斜面划曲线或直线。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,液体接种,操作方法与斜面接种基本一致，只是将接种环送入液体培养基中时使接种环与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散；,塞上棉塞，轻轻摇动均匀；,如果菌种培养在液体培养基中，使用移液管或滴管接种。,二、微生物接种和培养,三、微生物接种和培养,穿刺接种,用接种针调取菌种后，插入深层固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出；,此法用于厌气性细菌接种，检查细菌的运动能力。,二、微生物接种和培养,二、微生物接种和培养,平板接种,平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，以及活菌计数等；,平板接斜面：平板分散的单菌落接于斜面；,斜面接平板：点种法、划线法。,二、微生物接种和培养,三、微生物分离,微生物纯培养分离技术,纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。,获得纯培养物对微生物学研究至关重要。,微生物纯培养分离技术,涂布平板法,平板划线法,平板倾注法,稀释摇管法,液体培养基分离法,单细胞（孢子）分离法,选择培养基分离法,涂布平板法,1,、少量样品加到平板中央（,0.1mL,）；,2,、玻璃三角涂棒浸入酒精；,3,、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；,4,、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。,涂布平板法,样品需适当稀释,30-300CFU/mL,平板划线法,斜线法,曲线法,方格法,放射法,四格法,平板划线法,斜线法：,用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线,3-4,条，再转动培养皿,70,角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。,曲线法：,将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。,平板划线法,血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）,平板倾注法,对起始样品进行连续,10,倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获得单菌落。,培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。,稀释摇管法,适合厌氧菌的纯培养分离,无菌琼脂培养基试管加热,使琼脂熔化后冷却并保持在,50,左右,梯度稀释后的待分离菌株加入试管中,摇匀、冷凝,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌,液体石蜡和固体石蜡的混合物,培养后，菌落形成在琼脂柱的中间,液体培养基分离,不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。,稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。,在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过,95%,）表现为不生长。,单细胞（孢子）分离,单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。,较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。,个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。,单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。,选择培养基分离,选择培养基特性,促生长能力,抑制能力,指示（鉴别）能力,选择培养基分离,传统选择性培养基,血平板：,适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。,营养肉汤：,用于标本及各类细菌的增菌,巧克力血平板：,其中含有,V,和,X,因子，适于接种疑有,嗜血杆菌、奈瑟菌,等的标本。,中国蓝平板或伊红美蓝平板：,可抑制,G,+,细菌，有选择地促进,G,-,菌生长，是较好的弱选择性培养基。,麦康凯平板：,具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。,SS,琼脂：,有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。,碱性琼脂：,用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。,选择培养基分离,新型,显色培养基,利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的培养基。,Organism,Enzyme,Substrate,Color,Coliforms,-galactosidase,X-GAL,Blue,Escherichi,a coli,-,galactosidase,-,Glucuronidase,MUG,fluorescence,Escherichia coli,O157,-,galactosidase,X-GAL,Blue,选择培养基分离,基于酶与底物反应的显色培养基技术,CHROMagar,Petrifilm 3M,Aerobic Count Plate,Coliform Count Plate,Rapid Coliform Count Plate,E. coli,/Coliform Count Plate,Enterbacteriaceae Count Plate,Yeast and Mold Count Plate,Staph. aureus,Express Count Plate,Environmental,Listeria,Plate,基于酶与底物反应的显色培养基技术,四、微生物鉴定,四、微生物鉴定,多相鉴定（分类,),（,polyphasic taxonomy,）是利用微生物从,分子特性,到,生态特征,的多种不同信息，综合,表型,和,基因型,特征进行微生物分类鉴定的方法。,四、微生物鉴定,-,形态学观察,细菌,酵母,丝状真菌,宏观,形态（培养特征）,将培养物划线或稀释涂布，,30,培养,1624,小时，选取划线或稀释涂布分离得到单菌落，观察和记录菌落的形状、大小、质地、边缘、颜色、光泽、透明度、隆起等,。,将,培养物,划线接种于葡萄糖,-,酵母提取物,-,蛋白胨固体培养基上，,25,培养,2,3 d,后，进行菌落形态观察，菌落质地,、,菌落颜色,、,菌落表面是否为反光或暗淡,、,菌落是平伏还是隆起,、,菌落边缘,等,。,标准培养基,（,CA,、,CYA,、,WA,）,平板倒转，向上接种三点，每个菌株接种两个平板，倒置于,25,温箱中进行培养,7,天。观察菌落直径、颜色、质地、渗出液、菌落反面颜色等特征,。,微观,形态（细胞特征）,将培养物在,30,条件下培养,1624,小时，挑取对数期的单菌落，涂布于事先滴加少量无菌水的载玻片上，自然干燥，加热固定，进行革兰氏染色，将制好的染色涂片在,100X40,倍的显微镜下观察革兰氏染色情况、菌体形状、排列行状、菌体大小,等细胞特征。,培养物,划线接种于葡萄糖,-,酵母提取物,-,蛋白胨固体培养基上，,25,培养,2,3 d,后,，取酵母菌制作成水浸片，在显微镜下观察细胞形态,和,无性繁殖方式,等,。,用无菌接种针挑取少量培养物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，用接种针将菌丝团分散开，盖上盖玻片（勿使产生气泡），制成水浸片，显微镜下观察菌体形态特征，包括分生孢子梗、分生孢梗茎、顶囊、梗基、瓶梗、产孢结构、分生孢子头、分生孢子等,。,四、微生物鉴定,-,形态学观察,四、微生物鉴定,-,生理生化,碳源和氮源,运动性,细胞壁组成,渗透耐性,能源,氧关系,发酵产物,最适,pH,和生长范围,一般营养类型,光合作用色素,最适生长温度和范围,盐需求及耐性,发光,次级代谢产物形成,能量转换机制,对代谢抑制剂和抗生素的敏感性,贮藏内含物,四、微生物鉴定,-,生理生化,Division based on membrane composition:,a) gram-negative, have outer and inner membranes and,a thin cell wall (,Escherichia coli,),b) gram-positive, have no outer membrane, but have a,thicker cell wall (,Bacillus subtilis,),c) neither gram,-,nor gram,+,- no cell walls (mycoplasm),http:/www.med.sc.edu:85/fox/gram-st.jpg,http:/www.med.sc.edu:85/fox/bact-mem.jpg,四、微生物鉴定,-,生理生化,API (bioMerieux)(biochemical),四、微生物鉴定,-,生理生化,BBL Crystal (Becton Dickinson),将传统的生化反应、酶,底物呈色反应与荧光增强显色技术结合，设计鉴定反应最佳组合。,六类鉴定试验板，可鉴定,500,种细菌,四、微生物鉴定,-,化学成分分析,四、微生物鉴定,-,基因型分析,G+Cmol%,16S rDNA, 26S rDNA D1/D2, 5.8S rDNA ITS region,-tubulin gene, calmodulin gene,gyr,A gene,phe,S gene,recN,gene,rpo,B gene and other housekeeping genes.,DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA),DNA-DNA,hybridization,RAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR, Rep-PCR , LAMP.,四、微生物鉴定,-,基因型分析,DNA,指纹图谱分析,1,2,3,4,Eric-PCR,BOX-PCR,Rep-PCR,SSCP,ERIC,PCR,以细菌,DNA,中串联重复序列为引物， 通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，应用于菌株分型。,BOX-PCR,根据,BOX,插入因子,(,大小为,154 bp,由保守性不同的,box A(57 bp),、,box B(43 bp),和,boxC(50 bp),等亚单位组成,),设计引物,扩增微生物基因组,DNA,的重复性片段,最后经琼脂糖凝胶电泳检测其多态性。,REP -PCR,扩增细菌基因的重复,DNA,片段来获得菌株特异性遗传图谱,其中重复,DN A,片段包含了一个高度保守的回文序列,(REP),为,38 bp,的片段,由,1,个保守回文段以及两端分别有,6,个降解位点和,1,个,5 bp,的可变框构成。,PCR-SSCP,是聚合酶链式反应与单链,DNA,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合，利用不同构象单链,DNA,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异,检测出,DNA,短片段中存在的单核苷酸突变,现已广泛应用于各种基因多态性的研究。,假丝酵母,PCR-SSCP,副溶血弧菌,ERIC,PCR,沙门氏菌,REP -PCR,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,1,16S rDNA,序列系统发育树,infB,基因序列系统发育树,2007,年,Aspergillus brasiliensis,sp.nov.,新种发表,2008,年,ATCC 16404,鉴定为,Aspergillus brasiliensis,sp.nov.,2010,年,USP,将,ATCC 16404,更名,2010,年,WDCM,将,ATCC 16404,更名,图：,ATCC 16888,和,ATCC 16404,的培养特征和显微形态,anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th,et al,.,Aspergillus brasiliensis,sp. nov., a biseriate black,Aspergillus,species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932,图,: Rep-PCR,条码系统发育树,(DiversiLab,平台,),Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform),.,注：图片来源于,Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as,Aspergillus brasiliensis.,Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14,表,ITS,序列特殊位点碱基差异,Table Difference of base position in ITS sequence,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,2007,年,Aspergillus brasiliensis,sp.nov.,新种发表,2008,年,ATCC 16404,鉴定为,Aspergillus brasiliensis,sp.nov.,2010,年,USP,将,ATCC 16404,更名,2010,年,WDCM,将,ATCC 16404,更名,图,:,基于曲霉黑色组,-,微管蛋白基因序列的,N-J,树,Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.,注：图片来源于,Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932,图,1:,基于,ITS DNA,序列的黑色曲霉,N-J,树,Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.,注：图片来源于,Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as,Aspergillus brasiliensis.,Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,各种标准中仍将继续采用,ATCC 16404,作为质控菌株,。,各类,标准中，其它被指定为参考菌株的黑曲霉菌株,(CMCC(F) 98003),需要重新复核鉴定,。,黑曲霉,？,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,形态学鉴定,CYA,培养基, 25C,培养,7 d,Biolog,鉴定,生长浊度试验,ITS rDNA,区序列,分析,ITS4: 5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,ITS5: 5,-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3,-,微管蛋白基因序列,分析,Bt2a: 5,-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3,Bt2b: 5,-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3,反应体系：,100 L, 10 ,扩增缓冲液,10 L; DNA,模板,1 L ; dNTP (,每种,2.5 mmol/L) 8 L;,引物,(10 L/L),各,2.5 L;,Taq,DNA,聚合酶,(2.5 U/L)1.3 L;,无菌超纯水补足总体积,100 L,。,反应程序：,94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30,个循环,; 72C 10 min, 4C,保存,。,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,形态学鉴定,图,25C,培养,7 d,菌种的宏观形态和显微形态,Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 d,注,: A,菌落形态,; B:,分生孢子梗形态,( 100); C:,分生孢子形态,( 400).,Note: A: Colony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).,该菌株的形态学特征符合黑曲霉,A. niger,的形态特征,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,Biolog,鉴定,注,: :,没有生长,; +:,生长旺盛,; w:,微弱,(,边界,),生长,; v:,可变,.,Note: : No growth; +: Strong growth; w: Weak growth; v: Varied growth.,表,碳源利用情况,Table Carbon Source Utilization,碳源,Carbon source,ATCC16888,Aspergillus niger,ATCC16404,Aspergillus brasiliensis,CMCC(F)98003,麦芽糖,Maltose,+,+,-,甲基,-D-,葡萄糖苷,-Methyl-D-Glucoside,+,+,D-,海藻糖,D-Trehalose,+,+,L-,苹果酸,L-Malic Acid,v,+,-,酮戊二酸,-Ketoglutaric acid,w,苦杏仁苷,Amygdalin,+,+,D-,果糖,D-Fructose,+,v,+,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,ITS rDNA,区序列,分析,图,CMCC(F)98003,的,ITS rDNA,区序列和,-,微管蛋白基因序列,PCR,扩增结果,Fig ITS rDNA and -tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003,注,: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA,区,PCR,扩增结果,; 2:-,微管蛋白基因,PCR,扩增结果,.,Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR amplification result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.,表,ITS,序列特殊位点碱基差异,Table Difference of base position in ITS sequence,碱基位点,Base position,140,166,172,173,Aspergillus brasiliensis,IMI 381727,C,C,T,C,Aspergillus niger ATCC 16888,A,T,A,A,CMCC(F)98003,A,T,A,A,注,:,以,18S,和,ITS1,区之间的,TTACCG,序列中的第一个,“C”,为,1,位点,.,Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1.,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,ITS rDNA,区序列,分析,以,18S,和,ITS1,区之间的,TTACCG,序列中的第一个,“C”,为,1,位点,。,140,166,172,、,173,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,ITS rDNA,区序列,分析,图,基于,ITS,区,rDNA,序列的黑色组曲霉的,NJ,系统发育树,Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences,注,:,图中发育树节点只显示,Bootstrap,值大于,50%,数值,图例为遗传距离,.,Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.,CMCC(F)98003,与与,A. niger,ATCC 16888,聚类在分类距离最近的一个分支上,序列相似性达,100%,。,CMCC(F)98003,与黑色组的其他种序列同源性,也具有很高的相似性,序列同源性均在,98.6%100%,之间,。,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,-,微管蛋白基因序列,分析,图,基于,-,微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的,NJ,系统发育树,Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence data of,Aspergillus,section Nigri,注,:,图中发育树节点只显示,Bootstrap,值大于,50%,数值,图例为遗传距离,.,Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.,CMCC(F)98003,与黑曲霉,A,.,niger,CBS554.65,T,序列同源性为,100%,。,CMCC(F)98003,与黑色组的其他种序列同源性均在,94.7%,以下,。,结合形态学、碳源利用情况和,ITS rDNA,序列系统发育分析等多相鉴定的结果,将,CMCC(F)98003,鉴定为黑曲霉,（,Aspergillus niger,）。,四、微生物鉴定,-,鉴定实例,2,五、微生物保藏,菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。,菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。,中国微生物菌种保藏管理条例,五、微生物保藏,制订专门菌种保藏管理制度；,同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；,对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保藏设备中；,对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理；,设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。,五、微生物保藏,微生物菌种保藏方法,基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优良特性。,基本措施是低温、真空、干燥。,五、微生物保藏,常用菌种保藏方法,定期移植法,液体石蜡法,真空冷冻干燥法,-80,低温冻结法,液氮超低温冻结法,定期移植法,亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于,4,6,进行保存并间隔一定时间（,3-6,个月）进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。,操作步骤：,斜面制备 接种 培养 保藏,斜面制备,培养基配制,分 装,灭 菌,摆放斜面,接 种,培养,细菌,37 ,，,1-2d,酵母,2830,，,23d,丝状真菌,26 ,，,57d,保藏,46,保藏,36,个月,培养和保藏,定期移植法,操作简单，使用方便；,对设备和人员要求不高；,可随时使用，便于观察菌种；,工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高；,菌种传代频繁，易退化、污染。,液体石蜡法,指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（,4,6,）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。,操作步骤：,液体石蜡预处理,斜面培养物制备,灌 注 石 蜡,保 藏,优质化学纯液体石蜡,灭菌：, 121,湿热灭菌,30min,，蒸发水分；, 160 ,干热灭菌,2h,；,冷却至室温。,液面高出斜面顶部,1cm,4,6 ,，干燥处；,直立放置；,保藏时间,1,2,年。,液体石蜡法,操作简单，使用比较方便；,对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；,菌种易退化、污染。,真空冷冻干燥法,指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。,安瓿管的准备,清洗,选用中性玻璃材质的安瓿管；,2%,盐酸浸泡,8,10h,，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗,2,3,次；,置于烘箱中烘干,。,棉塞,打棉塞，,160,定型,2h,；,标签,激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约,1020mm,。,喷码于安瓿管外，,160,固定,20min,。,灭菌,121 ,，,30min.,保护剂的准备,保护剂：,12%,脱脂牛奶蒸馏水溶液，,2,5ml/,管；,灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，,113,灭菌,20min,；,打开放气阀缓慢排出蒸汽，,取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅速放入凉水中冷却；,30,培养,2,天，无菌检查合格后备用。,冻干样品制备,制备斜面培养物；,将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。,用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，,0.1,0.2ml/,管，操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。,真空干燥,在开动真空泵后应使真空度在,15min,内达到,66.5Pa,，随后逐渐达到,26.6,13.3Pa,，在此条件下，样品将保持冻结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。,终止干燥时间应根据下列情况判断,：,安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状,真空度接近空载时的最高值,样品温度与管外温度接近,选用,1,2,支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为干燥完结,预冻,制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过,1h,；,分装完成后将安瓿管立刻放入,35,40,冰箱预冻,1h,，使菌液完全冻结；,可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置,20,冻,30,分钟，再放入,80,冰箱冻,30min,；,采用离心式冻干装置时勿需预冻。,熔封,将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈；,将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封；,拉管时注意火焰不要离菌体太近。,真空度检测,用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝,光，说明真空度符合要求。,保藏,4,6,下避光保藏，,一般可保藏,8,10,年。,真空冷冻干燥法,保藏、运输方便；,保藏时间长,(5,10,年,),；,对设备要求高,(,真空冷冻干燥机、多歧管,),，对人员操作水平要求高；,冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。,-80,冰箱冻结法,将菌种悬浮于保护剂中，在,80,冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。,准备冷冻管,准备保护剂 （,10%-15%,甘油）,准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液）,制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）,保藏（,-80,，,2,5,年）,Microbank,-80,冰箱冻结法,使用方便；,保藏时间较长；,对设备要求高,(,-80,冰箱,),；,运输不方便。,液氮超低温冻结法,指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于,196,的液氮或,150,左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。,操作步骤,冷冻管准备,保护剂制备,保藏培养物准备,预冻,将程序降温系统预冷到,4,，将制备好的冷冻管放入其中，以,1/min,降温速率降至,-35,；,使用程序降温盒。,保藏,将预冻后的冷冻管转移至液氮气相,(-150),或液相,(-196),。,同“,80,冰箱冻结法”,液氮超低温冻结法,保藏时间长；,保藏效果好，菌种不易退化；,对设备要求高,(,程控降温仪、液氮罐,),，对人员操作水平要求高；,保藏成本高。,不同保藏方法的比较,六、质控微生物,保藏菌株要求,药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,92,2010,版中国药典,药品微生物实验室规范指导原则,国内认可的菌种收藏机构,1979,年,7,月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种保藏管理委员会（,CCCCM,），委员会下设,7,个全国性菌种保藏管理中心及机构所在地：,普通微生物菌种保藏管理中心（,CCGMC,）,中国科学院微生物研究所,农业微生物菌种保藏管理中心（,ACCC,）,中国农科院区划所,工业微生物菌种保藏管理中心（,CICC,），中国食品发酵工业研究院,医学微生物菌种保藏管理中心（,CMCC,），中国药品生物制品鉴定所,抗菌素菌种保藏管理中心（,CACC,），中国医科院医用生物技术研究所,兽医微生物菌种保藏管理中心（,CVCC,），农业部兽医药品监察所,林业微生物菌种保藏管理中心（,CFCC,），中国林业科学院,国认外可的菌种收藏机构,世界菌种保藏联合会,WFCC (World Federation Of Culture Collection),全球注册的菌种保藏机构,583,家,ATCC,NRRL,DSMZ,NCTC,CMI,CBS,NBRC(IFO),JCM,菌株代数,美国药典（,USP,）中规定：,“,将微生物接种至一新鲜培养基上,/,内，每萌发一次即称为一代，,”,并规定,“,菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过,5,代,”,。,United States Pharmacopoeia (USP) provides that: to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation, and provides that strains of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) must not exceed 5 generation.,“,我国的,GMP,认证中也如此要求，并且中国药典,2005,年版药典也已做出,“,菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过,5,代,”,这个明确的规定。,Chinas GMP certification is asking, and the Chinese Pharmacopoeia 2005 edition of Pharmacopoeia also had a strain of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) should not exceed 5 on behalf of The clearly defined.,Enrichment (G1),Separation of single-olony(G2),Working strain (W3),Working strain (W4),Working strain (W5),标准菌株提供形式,Accuracy,Easy of Use,(preparation),High,Low,Complicated,Easy,Quanti Cult (REMEL),Standard Strains (ATCC/NBRC etc.),EZ-CFU one step (MicroBioLogics),KWIK-STIK (MicroBioLogics),Culti Loops (REMEL),BioBall (BTF/bioMerieux),质控菌株,Primary strain,Qualitative strain,Quantitative strain,视频材料,质控菌株的使用,质控菌株,