siRNA和miRNA

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,单击此处编辑母版标题样式,*,南京农业大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第五章,siRNA,和,miRNA,介导的调控,20,世纪,50,年代中期，人类发现生命的遗传物质是,DNA,双螺旋。这之后过了十多年，人们才发现了,RNA,，它们是联系,DNA,和蛋白质的“桥梁”，是细胞里的信使（信使,RNA,）、运输工具（转运,RNA,）和“车床”（核糖体,RNA,）上的关键零件，因此它们看起来好像一直在默默地干着一些替,DNA,跑腿的杂活。长久以来，生物学家们从来没有认为,RNA,会是生命中最重要的一份子。越来越多的证据清楚的表明，,RNA,在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。,Traditional RNAs,RNA,的分类,细胞核和胞液 线粒体 功能,核蛋白体,RNA,rRNA,mt,rRNA,核蛋白体组成成分,信使,RNA mRNA,mt,mRNA,蛋白质合成模板,转运,RNA,tRNA,mt,tRNA,转运氨基酸,不均一核,RNA,hnRNA,成熟,mRNA,的前体,小核,RNA,snRNA,参与,hnRNA,的剪接、转运,小胞浆,RNA scRNA/7SL-RNA,蛋白质内质网定位合成的,信号识别体的组成成分,近些年来，人类发现了许多不同种类的,RNA,分子，其中最为重要的是小,RNA,分子的发现。,有些小,RNA,分子 能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型。,在,2001,年度,Science,评选的,10,大科学成就中,RNAi,名列榜首。随着对小分子,RNA,研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子,RNA,的世界一点都不小。有人推测：小分子,RNA,可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。,小,RNA,分子本身又包含了若干类,RNA,，根据小,RNA,的生成、结构和功能大约可分为以下几类：,RNAi,的研究历程,2024年9月13日,8,1995,，,RNAi,现象首次在线虫中发现。,1998,，,RNAi,概念的首次提出。,1999,，,RNAi,作用机制模型的提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现,RNAi,现象。,2001,，,RNAi,技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。,RNAi,技术被,Science,评为,2001,年度的十大科技进展之一。,至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门的方向之一。,2024年9月13日,8,内容纲要,一、,RNA,干扰及其机制,二、,MicroRNAs,在发育中的调控作用,三、,RNAi,与异染色质,四、,miRNA,在癌症发生中的作用,五、,siRNA,的应用,2024年9月13日,10,RNA,干扰（,RNAi,）是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物,mRNA,存在同源互补序列的双链,RNA(double,strand RNA ,dsRNA,),导入细胞后,能特异性地降解该,mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,由于,RNAi,发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（,post-transcriptional gene silencing, PTGS,）。,RNA,干扰是一种重要而普遍表观遗传的现象。,2024年9月13日,10,一、,RNA,干扰及其机制,RNA,干扰的发现,1. 1990,年，,Rich Jorgensen,将由强启动子控制的,Chalcone,synthase,gene,转入淡紫色的矮牵牛花,-,加深紫色,2.,Hypopigmentation,:,许多花出现杂色，甚至紫色消失，变成白色,3. Co-suppression,RNA,干扰：线虫,1. 1995,年，,Su,Guo,and Kenneth J.,Kemphues,，线虫,2.,利用反义,RNA,技术阻断线虫中的,par-1,基因。在对照实验中给线虫注射正义,RNA,以期观察到基因表达的增强。,3.,然而，正义,RNA,和反义,RNA,都能够有,效地抑制基因的表达！,4.,沉默的效应能够在被注射的动物及其后,代中保持，虽然,RNA,转录本在胚胎早期就,发生降解。,双链,RNA,与其序列同源的基因的表达,RNA,干扰,1. “RNA Interference”:,注,入,dsRNA,能够有效地、长期,的阻断基因的表达,2.,给线虫喂食表达,GFP,dsRNA,的细菌，线虫的,GFP,表达被抑制,(a),，但存在,RNAi,缺陷的则不被抑制,(b),3.,之前的正义,RNA,抑制基因,表达的现象，可能是由于体,外转录所得,RNA,中污染了微,量双链,RNA,而引起,植物免疫系统,1.,植物细胞可以通过降解病毒,RNA,的方式来对抗,病毒的入侵，称为转录后沉默,(PTGS),2.,外源基因诱导的,RNA,沉默是植物对抗病毒和转座,子的一个防御系统,3.,绝大多数的植物病毒具有单链,RNA,基因组，进入,细胞之后从释放其基因组，由病毒编码的,RNA,polymerase,产生正义和反义的,RNA,，并形成,dsRNA,，触发,RNAi,机制从而抵制其自身的序列,RNA,干扰的过程,1.,从双链,RNA,产生的小干扰,RNA,可以用不同机制关闭基因的细胞机器,2.,为什么外源的,dsRNA,能够抑制与其序列同源的基因的表达？,RNA,干扰的分子机器,1. Dicer:,RNase,III,类似的，包含多个功能结构,域的核糖核酸酶，将,dsRNA,切割成小的,short,interfering,RNAs,(,siRNAs,) or,microRNAs,(,miRNA,),，并将这些产物加载到,RISC,上,2. RISC (RNA induced silencing complexes),(RNA,诱导的沉默复合体,):,包含多个蛋白质的复,合物，将与之连接的,siRNA,或,miRNA,定位到其靶,点并抑制靶基因的表达。,Dicer,序列的结构组成,:,1.,一个,PAZ,结构域，与,dsRNA,的末端结合,2.,两个,RNase,III,结构,3.,其他的功能结构域,Dicer,1. PAZ,有一个,OB,折叠，与,ssRNAs,的,3,端有较弱的亲,和力，允许,PAZ,与,dsRNAs,露在外面的两个核苷酸结合,2. Dicer,的,PAZ,结构域能够,识别,Drosha,切割的产物末,端,Dicer,的三级结构,1. PAZ,结构域与两个具有催化活性的,RNase III,结构域分离,2.PAZ,结构域与,RNase III,结构域的距离为,65A,，与,25,个,bp,的,RNA,长度一致,3. Dicer,是一个分子尺，负责识别,dsRNA,并在特异位点切断,RISC,Argonaute,(AGO),：,RISC,的核心成员,1.,Argonaute,(AGO):,大的蛋白质家族，为,RISCs,的核心成员,2. AGO,蛋白质一般包含,PAZ,和,PIWI,两种功能结构域,3. PAZ,与双链,siRNA,3-,端露出的两个核苷酸结合,4. PIWI,负责将双链,siRNA,切成单链,5. PAZ,和,PIWI,对于,siRNA,与底物,mRNA,之间的相互作用是必须的，并负责底物的断裂或转录抑制,6.,不同的,AGO,具有不同功能，例如人类,AGO2,负责的,RISCs,能够割裂底物,mRNA,，而,AGO1,和,AGO3,则不能,siRNA,介导的,mRNA,割裂,RISC,的加载与激活,RNA,干扰,1.,dsRNA,首先需要被,Dicer,相关的复合物进行处理，然后在,Argonaute,相关的复合物的引导下发挥功能；,2. Dicer,和,Argonaute,家族的成员在,RNA,诱导的沉默通路中发挥功能，不同的组成通过不同的机制引起沉默,3.,例如，不同的,Argonaute,相关复合物能够引起不同的沉默过程,(mRNA,降解,vs.,翻译抑制,),小干扰,RNA,（,small interfering RNA;,siRNA,） 和微小,RNA,（,microRNA,；,miRNA,）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小,RNA,的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小,RNA,的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。,27,miRNA,结构：,21-25nt,长的单链小分子,RNA,，,5,端有一个磷酸基团，,3,端为羟基，由具有发夹结构的约,70-90,个碱基大小的单链,RNA,前体经过,Dicer,酶加工后生成。,特点：具有高度的保守性、时序性和组织特异性 。,27,28,28,m,iRNA,介导的,RNAi,miRNA,的研究起始于时序调控小,RNA,（,stRNAs,）。,1993,年，,Lee,等在秀丽隐杆线虫（,Caenorhabditis,elegan,）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因,lin-4,。,2002,年，,Reinhart,等又在线虫,C.elegan,中发现第二个异时性开关基因,let-7,。,2001,年,10,月,science,报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似,C.elegan,的,lin-4,的小,RNA,基因，称为,microRNA,。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个,miRNAs,。对一部分,miRNAs,的研究分析提示：,miRNAs,参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生 。,What are,microRNAs,？（,1,）,miRNA,是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的,RNA,家族，它们是由,19-25,个核苷酸（,nt,）组成的单链,RNA,（,3,端可有,12,个碱基长度的变化）；,miRNA,的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的,miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的,miRNA,表达；,编码,miRNA,的基因可位于基因组的非编码区，以及编码蛋白质基因的内含子、外显子和非翻译区。这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。,What are,microRNAs,？（,2,）,miRNA,具有,高度保守性,，即各种,miRNA,都能在其他种系中找到同源体；,miRNA,独有的特征：其,5,端第一个碱基对,U,有强烈的倾向性，而对,G,却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏,U,，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏,C,miRNA,执行一定的,生物学功能,：,对与其互补的,mRNA,表达水平具有调节作用；,一些偏大的,miRNA,可能参与了基因组的重组（,27nt,）；,miRNA,的成熟,据体内外实验研究表明,miRNA,的生成至少需要两个步骤：,1,）由长的内源性转录本（,pri-miRNA,),生成,70nt,左右的,miRNA,前体（,pre-,miRNA,),，该过程发生在细胞核,;,2),将,pre-,miRNA,加工为成熟,miRNA,，该过程发生在细胞质中。,Structure of pri-miRNAs,(A),pri-miRNAs,的结构,(B),人类,pri-miR-30a RNA,的发夹环；,Drosha,切割位,点,(,箭头,),，,Dicer,切割位点,(,三角,),Pre-,miRNA,Pre-,miRNA,是由内源性基因间区或内含子的,DNA,反向重复序列转录而来,它是一种长约,70nt,的非编码,RNA,具有茎,-,环结构也即发夹状结构。,Pre-,miRNA,在,Dicer,的作用下可被剪切成,miRNA,miRNA,只是,pre-,miRNA,茎中的一个臂,miRNA,的加工,1.,Pri-miRNA,被,Drosha,切割,2. pre-,miRNA,被,Dicer,切割,3.,Exportin,5 (Exp5),将,miRNA,装运到胞质中,Drosha vs Dicer,1. RIII, RNase III,催化结构域,; D, dsRNA,结合结构域,;,PRORICH, proline-rich,结构域,; RS-RICH, arginine/serine,rich,结构域,2. Drosha,和,Dicer,都具有,RNase III,和,dsRNA,结合结构域,MicroRNAs,的多样性,1.,miRNAs,发现的数量近年来快速增长,2. 2006,年,10,月，,miRBase,9.0,，收录,4361,个具有发夹结构的前体,miRNAs,，能够表达出,4167,个,miRNA,产物,3. Release 12.0,，收录,8619,个具有发夹结构的前体,miRNAs,，能够表达出,8273,个,miRNA,产物,MicroRNAs,的多样性,拟南芥：187,154,152,人：695！,miRNA,与靶,mRNA,的作用模式：,1,）二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程（阻遏翻译）而对,mRNA,的稳定性无任何影响。这种,miRNA,是目前发现最多的种类。如线虫的,lin-4,。,2,）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似,siRNA,与靶,mRNA,的结合，特异性的切割,mRNA,。如,miR39/miR171,当,miRNAs,和编码蛋白质的,mRNA,几乎完全配对时，,miRNAs,诱导,RNA,介导（,RNAi,）的干扰途径。,3,）上述两种模式均具备。当其与靶,mRNA,完全互补配对时，直接靶向切割,mRNA,，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如,let-7,果蝇,/,线虫。,miRNA,的调控特点,交叉调节：,动物,miRNA,与靶,mRNA,之间的不完全配对使得任何一,个,miRNA,都可能作用于不同的,mRNA,，一个,mRNA,也可能受到多个,不同,miRNA,的调节。,自我调节：,自我调节参与了,miRNA,的生物合成和功能。例如,参与,miRNA,生物合成的一些酶也受到其产物,miRNA,的调节。,Dcl1 mRNA,编码一种植物,Dicer,蛋白参与,miRNA,的生成,同时它也是,miR2162,的靶分子。,可逆性调节：,miRNA,所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当,mRNA,作,为,miRNA,抑制的靶分子后, mRNA,会被送至胞浆内的,P (,Pbodies,),重新定位。,miRNA,调节方式的优点,与蛋白水平的调节相比，更加节省能量,与转录水平调节相比，,miRNA,调节更迅速，而且是可逆的,内含子所编码的,miRNA,是一种对基因组资源的高效利用,microRNA,基因组分布,60%,独立表达,15%,成簇表达,25%,的,miRNAs,位于内含子,植物与动物,miRNA,的区别,动物,植物,前体茎环结构,短，简单,长，复杂，折回长度变,异明显,加工过程,作用机制,先在细胞核，后在细胞质 仅在细胞核中,大部分作为翻译阻遏子， 大部分介导靶,mRNAs,小部分导致靶,mRNAs,降解,的,降解,长度,保守性,22-23nt,高,21nt,更高,经典理论：,2008 Nature,小结,miRNA,的作用是多种多样的,它既可以通过关闭一些关键,基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用,形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。,大多数,miRNA,并非独立作用,而是参与到复杂的基因调控网,络中。,据推测,人类三分之一的,mRNA,都被,miRNA,调控,随着它们的,作用机理逐步明了,相信将会给人类带来更多的福音。,由于,RNA,病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了,dsRNA,（注：病毒入侵，或者是自身合成,RNA,中出现错误，细胞内就会产生双链,RNA,，来阻止这些异常基因的表达）。,siRNA,在,Dicer,酶的作用下，这些双链,RNA,被加工成,20-25nt,的,siRNA,，而后这些,siRNA,被组装进入一种,RNA,诱导的沉默复合体（,RNA-inducedsilencing complex,，,RISC,，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶,mRNA,进行识别和切割）。最后，这些,siRNA,与靶,mRNA,分子互补配对，并引导,RISC,剪切、降解,RNA,分子。,因此说,siRNA,只降解与其序列互补配对的,mRNA,。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。,49,siRNA,siRNA,结构：,21-23nt,的双链结构，序列与靶,mRNA,有同源性，双链两端各有,2,个突出非配对的,3,碱基。,siRNA,功能：是,RNAi,作用的重要组分，是,RNAi,发生的中介分子。内源性,siRNA,是细胞能够抵御转座子、转基因和病毒侵略,的,屏障,。,49,50,50,siRNA,介导的,RNAi,51,siRNAi,的特点：,高效性和浓度依赖性,特异性,位置效应,时间效应,细胞间,RNAi,的可传播性,多基因参与及,ATP,依赖性,51,小干扰,RNA,（,small interfering RNA;,siRNA,） 和微小,RNA,的异同点,miRNA,与,siRNA,的作用机制：,2024年9月13日,54,2024年9月13日,54,相同点,/,联系点,siRNA,miRNA,长度及特征,都约在,22nt,左右，,5,端是磷酸基，,3,端是羟基,合成的底物,miRNA,和,siRNA,合成都是由双链的,RNA,或,RNA,前体形成的,Dicer,酶,依赖,Dicer,酶的加工，是,Dicer,的产物，所以具有,Dicer,产物的特点,Argonaute,家族蛋白,都需要,Argonaute,家族蛋白参与,RISC,组分,二者都是,RISC,组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了,on target,和,off target,的问题,作用方式,都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致,mRNA,降解，即在转录水平后和翻译水平起作用,进化关系,可能的两种推论：,siRNA,是,miRNA,的补充，,miRNA,在进化过程中替代了,siRNA,不同点,/,分歧点,siRNA,miRNA,机制性质,往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入,dsRNA,之后诱导而产生，属于异常情况,是生物体自身的一套正常的调控机制,直接来源,长链,dsRNA,发夹状,pre-,miRNA,分子结构,siRNA,是双链,RNA,，,3,端有,2,个非配对碱基，通常为,UU,miRNA,是单链,RNA,对靶,RNA,特异性,较高，一个突变容易引起,RNAi,沉默效应的改变,相对较低，一个突变不影响,miRNA,的效应,作用方式,RNAi,途径,miRNA,途径,生物合成，成熟过程,由,dsDNA,在,Dicer,酶切割下产生,;,发生在细胞质中,pri-miRNA,在核内由一种称为,Drosha,酶处理后成为,60nt,的带有茎环结构的,Precursor,miRNAs,(pre-,miRNAs,),；这些,pre-,miRNAs,在转运到细胞核外之后再由,Dicer,酶进行处理，酶切后成为成熟的,miRNAs,；发生在细胞核和细胞质中,Argonaute,(AGO),蛋白质,各有不同的,AGO,蛋白质,各有不同的,AGO,蛋白质,互补性,（,complementarity,）,一般要求完全互补,不完全互补，存在错配现象,RISCs,的分子量不同,siRISCs,miRISCs/miRNP,各自的生物学功能不同,抵抗病毒的防御机制,沉默那些过分表达的,mRNA,保护基因组免受转座子的破坏,对有机体的生长发育有重要作用,重要特性,高度特异性,高度的保守性、时序性和组织特异性,作用机制,双,链的,siRNA,结合到,RISC,复合物中，引导复合物与,mRNA,完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开,siRNAs,，通过反义,siRNA,链识别目的,mRNA,片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，,siRNA,也可以阻遏,3UTR,具有短片断互补的,mRNA,的翻译（,off target,）。,成熟的,miRNAs,则是通过与,miRNP,核蛋白体复合物结合，识别靶,mRNA,，并与之发生部分互补，从而阻遏靶,mRNA,的翻译。在动物中，成熟的单链,miRNAs,与蛋白质复合物,miRNP,结合，引导这种复合物通过部分互补结合到,mRNA,的,3UTR,（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，,miRNA,也可以切割完全互补的,mRNA,。,加工过程,siRNA,对称地来源于双链,RNA,的前体的两侧臂,miRNA,是不对称加工，,miRNA,仅是剪切,pre-,miRNA,的一个侧臂，其他部分降解。,对,RNA,的影响,降解目标,mRNA,；影响,mRNA,的稳定性,在,RNA,代谢的各个层面进行调控；与,mRNA,的稳定性无关,作用位置,siRNA,可作用于,mRNA,的任何部位,miRNA,主要作用于靶标基因,3,-UTR,区,生物学意义,siRNA,不参与生物生长，是,RNAi,的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染,miRNA,主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达,不同点,/,分歧点,siRNA,miRNA,二、,MicroRNAs,在发育中的调控作用,1. lin-4,和,let-7,miRNAs,调控线虫发育的时间点,lin-4,在幼虫发育过程中的作用,在线虫的幼虫发育期，,lin-4,下调,LIN-14,和,LIN-28,蛋,白质的浓度，从而一方面阻止后期发育，一方面促,进幼虫的发育,lin-4,：不完美的剪辑配对,miRNA gene discovery,1. Forward genetics:,lin-4 & let-7,2. Reverse genetics:,miR-181, mir-273,lsy-6,和,mir-273,决定神经细胞的分化,1. Asymmetric chemosensory neurons,（非对称的化学感应神经元）,：ASE,left(ASEL,) and ASE right (ASER),感受环境的化学刺激,2. ASEL,表达,gcy-7, ASER,表达,gcy-5,，化学受体,miRNA,在脊椎动物发育中的功能,miR-124a,和,miR-1,的功能,1.,在,Zebrafish,Medaka, Mouse,和,Fly,中表达,miR-124a,和,miR-1,2. miR-124a,仅在鱼和鼠的脑以及脊髓中表达，在,果蝇的腹神经索中表达,3. miR-1,仅在小鼠的肌肉和心脏中表达,4. miR-124a,和,miR-1,的序列保守性高,miRNA,控制植物表型特征,jaw-D,的突变对,TCP,基因表达的影响,miRNA,调控造血干细胞的分化,1. 3,种,miRNA,控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程：,miR-181,，,miR-223,，,miR-142s,2. miR-181:,主要在小鼠骨髓的,B-,淋巴细胞中表达,3. miR-223:,骨髓原细胞,病毒编码的,miRNAs,病毒编码的,miRNAs,SV40,编码的,miRNAs,1.,降低细胞毒素,T,淋巴细胞,(cytotoxic T lymphocytes),识别裂解的能力,2.,病毒早期转录肿瘤抗原,(T,antigen),3.,在转录后期，,SV miRNAs,结合早期的肿瘤抗原，并使之降解,4.,降低肿瘤抗原的浓度，从而降低细胞毒素,T,淋巴细胞识别的可能性,腺病毒的,VA1 RNA,1. Adenovirus virus-associated 1 (VA1) RNA.,2.,在核里与其它前体,miRNA,竞争与,exportin-5,的结合，竞争与,Dicer,的切割,3.,干扰免疫应答,宿主,miRNA vs,病毒基因组,1.,宿主,miR-32,与,primate foamy virus,(,灵长类泡沫病毒,),type 1,结合限制其扩增，病毒的,Tas,能够抑制该过程,2.,肝特异性的,miR-122,能够与,HCV,(,丙肝病毒,),结合，使其扩增，可能是激活病毒的复制，或者改变其亚定位,三、,RNAi,与异染色质：,Fission yeast,1.,RNAi,调控异染色质的沉默与组蛋白,H3K9,的甲基化,;,2.,在,fission yeast,中删除,argonaute, dicer,等基因，破坏,RNAi,机制，发现动粒附近的异染色质重复片段表达异常的转录本,3.,由,H3K9,的甲基化缺失导致转录激活，损伤动粒的功能,4.,动粒的重复片段，其转录沉默的状态由,H3K9,的甲基化以及染色质与,Swi6,结合所决定。,RNAi,促使异染色质化,1.,RNAi,的分子机器对动粒重复片段的异染色质化的起始和维持是必须的,1.,动粒反链的转录片段,被,RNAi,沉默并降解,2.,动粒正链转录本低表达，被,Rdp1,扩增并产生,siRNA,3. Rdp1,与染色质结合，,促进,siRNA,介导的组蛋白修饰,RNAi,促使异染色质化,异染色质的形成,1.,重复片段相关的,siRNA,(rasiRNA),通路：,2.,重复片段的双链的相对的启动,子转,录，形成长链,dsRNA,3.,由,Dicer,切割成,siRNAs,4.,与,RISC,结合，引起同源,DNA,的沉,默,5.,确立沉默的状态，引发,DNA,甲基化和组蛋白甲基化，并招募异染色质结合蛋白质,RNAi,与异染色质：植物,1.,dsRNA,与染色质沉默密切相关,2.,植物的转基因被同源,dsRNA,的表达所沉默，并使同源,DNA,区域发生甲基化,3.,由,siRNA,介导，甲基转移酶能够被招募到靶基因的位点,四、,miRNA,在癌症发生中的作用,1.,人中已发现,695,个,miRNAs,，命名为：,has-,miRx,2.,miRNA,在癌症发生中表达谱的变化,:,检测,334,个哺乳动物样本中的,217,个,miRNAs,的表达情况,3.,与正常组织相比，,miRNAs,在肿瘤中的表达显著的下调,4.,与,mRNA,相比，,miRNA,的表达谱是一个很好的癌症分类指标,miRNA,调控癌基因的表达,1.,c-Myc,调控的,miRNA,控制,E2F1,的表达,2.,c-Myc,是一个具有,helixloophelix,的亮氨酸拉链的转录因子，调控人类和果蝇基因组中约,1015%,的基因的表达,3.,c-Myc,激活人类,13#,染色体上成簇的六个,miRNAs,4. E2F1,是一个转录因子，在,c-Myc,的下游，促使细胞周期的发生,5. E2F1,的表达受到,miR-17-5p,和,miR-20a,的负调控,c-Myc,诱导,miRNA,的表达,1.,Tet,: tetracycline (,四环素,),，降低,c-Myc,的表达,c-Myc,诱导,miRNA,的表达,1. +/+:,野生型,2. -/-: c-Myc,敲除,3. -/-(Myc): c-Myc,敲除,后再转入外源,c-Myc,基因,miRNA,：肿瘤抑制因子,1. p53,调控,miR-34ac,的表达,2.,在,DNA,损伤以及癌基因压力的情况下，通过依赖于,p53,的通路中诱导,3.,在肿瘤及其分化的细胞株中过表达,miR-34,能够抑制细胞周期的过程,miRNA,：,可能是致癌基因,1. mir-1792,的基因簇在人类,B,细胞淋巴瘤中扩增，与正常细胞相比，其表达量明显上调,2. mir-1792,的基因簇与,c-myc,协同作用，促进小鼠中,B,细胞淋巴瘤的生长,3.,从造血干细胞中分化的肿瘤表达,mir-1792,的基因簇的一部分，阻止细胞凋亡，是,c-myc,诱导的淋巴瘤中广泛存在的想象,mir-1792,基因簇,1. 46,个淋巴瘤样本和,47,个直肠癌的样本,vs.,正常组织,2. mir-1792,基因簇表达明显的上调,五、,siRNA,的应用,1.,siRNA,一般,2123bp: 19bp,的双链互补区，两边对称的、伸出的序列，,5-phosphate (P) and 3-hydroxyl (OH),基团,.,2.,正义,siRNA,的,5,端稳定性较高，,3,端稳定性较低，切割位点稳定性也较低,siRNA,设计的原则,1. mRNA,的,ATG,下游,50-100bp,，最好,75bp,2.,效率较高的,siRNA,设计模体,: AAN,19,TT,NAN,19,NN, NARN,17,YNN, NANN,17,YNN,3. 50%GC,含量,(30-70%),4.,尽量避免三个连续相同的核苷酸，尤其是,GGG,5.,避免序列上已知是,mRNA,结合蛋白质位点的部分,6.,使用,BLAST,搜索核酸数据库，以保证其唯一性,siRNA,的设计,1.,将外源的,siRNA,转入细胞中,(,暂时的表达,),化学合成,:,较贵,2.,使用,T7,启动子体外转录前体,miRNA,体外表达的,dsRNA,能够被大肠杆菌的,RNase III,或,RNase III-like DICER,所切割,在细胞或者动物模型中表达,siRNA,3.,使用,pol III,启动子表达,siRNA,siRNA,的设计,利用,Pol III,启动利用启动子表达,hairpin RNA(shRNA),1. U6,或,H1,的,RNAP III,启动子，终止信号,TTTTT,2.,在各种组织中都能够有效地表达,shRNA,3. (a),将互补的,hairpin RNA (HP),构建到一起；,(b),分别构建，转录后形成双链,哺乳动物中,siRNA,载体的构建中,siRNA,载体的构建,人类细胞中,siRNA,载体的构建,siRNA,的应用,1.,产生在长时间内可被观测的表型,2.,设计在体外或体内稳定的细胞系，在异种移植,模型中，检测血管生成、肿瘤细胞迁移的可能性,3.,快速的在转基因小鼠中建立亚等位基因,4.,将,shRNAs,与已知的、高效的基因投递装置结,合，形成有效的基于,RNAi,的治疗方案,RNAi,体内合成用各种载体的比较,RNAi,激活免疫应答通路,RNAi,的应用,总结,1. RNA interference:,siRNA,miRNA,以及,RNAi,的分子机制,2.,miRNAs,的功能,:,动物的生长发育等,3.,miRNA,在癌症发生中的作用,: biomarker,作用机理,4.,siRNA,的应用,:,产生,siRNA,的方法，,siRNA,在基础研究以及治疗方面的应用,