SSR分子标记精讲

单击鼠标编辑标题文的格式,单击鼠标编辑大纲正文格式,第二个大纲级,第三个大纲级,第四个大纲级,第五个大纲级,第六个大纲级,第七个大纲级,第八个大纲级,第九个大纲级,*,专业综合能力训练与测试,利用,SSR,技术,进行玉米杂交种的纯度鉴定,2012.5,一、,实验目的,玉米是我国的主要农业作物，利用,SSR,技术进行玉米种子纯度鉴定，已经筛选出多对可利用的引物，综合运用,SSR,核心引物和,DNA,指纹图谱，可以准确地鉴定父本、母本、混杂品种及真实杂交种，其鉴定结果与,RFLP,结果及系谱来源基本一致。,SSR,标记的简介及原理,SSR,标记的步骤及分析,SSR,标记引物设计,二、,SSR,标记,1,2,3,SSR,（,simple sequence repeat,）,SSR,标记,简单重复序列（,Simple Sequence Repeat,，,SSR,）,，指的是基因组中由,1-6,个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段,DNA,，,广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在,200 bp,以下。,SSR,标记是一种通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在的核苷酸排布及其外在状态表现规律的技术。,1. SSR,标记的简介,SSR,分子标记的分子学基础,微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核,DNA,中。在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的,常见的二核苷酸重复单位：,（,AC)n,、（,GA)n,、（,AT)n,常见的三核苷酸重复单位：,（,AAG)n,、（,AAT)n,SSR,分子标记的分子学基础,微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的,SSR,在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了,SSR,标记 。,SSR,分子标记原理,根据两端序列的保守性，设计引物；进行,PCR,，电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成功鉴定的目的。,简而言之，,就是通过对样本,DNA,多态性的分析，从而来得到样本,DNA,序列以及在遗传性状上的调控和差异。,SSR,标记原理示意图,SSR,分子标记的优势,SSR,在真核生物基因组中分布广,多态性丰富,其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信,息量大,SSR,通常为显性标记，呈孟德尔式遗传,具有很好的稳定性和多态性,DNA,用量少,技术要求低，成本低廉,PCR,扩增的可重复性高,SSR,分子标记的劣势,开发和合成新的,SSR,引物投入高、难度大,现有的,SSR,标记数量有限，不能标记所有的功能基因,SSR,多态性的检测和应用很大程度上依赖,PCR,扩增的效果,SSR,座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。,2. SSR,分子标记的步骤,第一步,：基因组,DNA,提取,第二步,：,PCR,第三步,：扩增产物电泳检测,第四步,：结果分析,微卫星分子标记对,18,份基因型的扩增结果,引物,设计,二,三,一,从有关数据库（,GenBank, EMBL DDBJ,等）或文章中查询,使用近缘种的引物,构建基因组文库,筛选,SSR,位点,3. SSR,分子标记,引物设计,构建基因组文库,筛选,SSR,位点,5,锚定,PCR,分离,SSR,标记,K,可以跟任何核苷酸配对，,V,不能与,A,配对，,R,不能与,G,配对，其他核苷酸均可与它们配对。这样，,VRVRV,五个碱基一起构成了一个封闭碱基群。在,PCR,过程中，由于,VRVRV,不能与,GA,配对，该引物与模板,DNA,结合的时候，就不会在,(GA)n,重复区滑动，只会结合在如图,1,所示的位置上，以保证,SSR,位点的长度多态性不会丢失。,三、实验用品,仪器设备与耗材：,PCR,扩增仪、电泳仪和电泳槽、微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心管、,PCR,管、移液器枪头等,2.,试剂,提取缓冲液：,100mmol/L,TrisCl,，,20mmol/L,EDTA,，,500mmol/L,NaCl,，,1.5% SDS,。,氯仿：异戊醇：乙醇（,80,：,4,：,16,）。,TE,缓冲液：,10mmol/L,TrisCl,（,pH8.0,），,1mmol/L EDTA,（,pH8.0,）。,SSR,引物（,20,对）, Taq,DNA,聚合酶（,3U/l),dNTPs,（,10mmol/L,）,1.,材料准备：,在温室种植,10,种不同来源的玉米杂交种，剪取其三叶期左右嫩叶以备,DNA,提取之用。,四、实验操作步骤,2. DNA,提取,将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约,0.1g,放入,1.5ml,离心管中，立即加入,0.5ml,提取缓冲液（,60,水浴预热），摇动混匀。,60,水浴保温,3060min,（时间长，,DNA,产量高），不时摇动。,加入,0.5ml,氯仿：异戊醇：乙醇（,80,：,4,：,16,）溶液，颠倒混匀，室温下静置,510 min,，使水相和有机相分层。,室温下,12000rpm,离心,5 min,。,小心移取上清液至另一,1.5ml,离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状,DNA,沉淀。,室温下,12000rpm,离心,5 min,，去除上清液，再加入,100l TE,溶解沉淀。,加入,1/10,体积（约,10l,）的,3mol/L,NaAc,及二倍体积（约,300l,）预冷的无水乙醇，混匀，,-20,放置,20 min,左右。,室温下,12000rpm,离心,5 min,。,去上清，用,1ml 70%,乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入,100l TE,溶解，,-20,贮存,备用。,3. PCR,扩增,反应组分,Component,反应体积,Volume(25L),dd,H,2,O,19L,10buffer,2.5L,dNTPs(10mM),2L,Primer forward(10,uM,),0.5L,Primer reverse(10,uM,),0.5L,DNA template,（,100,ng/L,）,0.25L,Taq,DNA ploymerase(5U/l),0.25L,每小组选用,3,个模板，,3,对引物，进行如下的,PCR,扩增。,PCR,反应程序 ：,预变性,94 5min,变性,94 30s,退火,55 30s,延伸,72 30s,共,33,个循环,最后,72,终延伸,10min,4.,电泳检测：,将扩增产物在,3,的琼脂糖凝胶中电泳，经,EB,染色后观察结果并照相。,5.SSR,标记分析,1.,分析不同杂交种间的特异性的条带差异情况,2.,筛选出鉴定杂交种的,SSR,标记,五、问题与思考,1.SSR,鉴别种子纯度的原理,2.SSR,标记电泳的结果及分析,3.SSR,标记在鉴定杂交种的实用性如何？,Thank you !,