《食品毒理学》课件第七章

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,7,章 食品毒理学实验基础,Chapter 7 Experimental Basis for Food Toxicology,本章学习目的与要求,掌握实验动物的选择原则和方法；,熟悉实验动物的常规处置、染毒方式、采样和处死方法；,了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育和解剖生理特征。,掌握食品毒理学实验设计基本原则；,熟悉毒理学试验结果处理和分析方法。,第一节 食品毒理学实验的原则和局限性,在毒理学的试验中，有三个基本的原则。,1.,化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。,人是最敏感的动物物种；人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重,(,或体表面积,),相关。,这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。,2.,实验动物必须暴露于高剂量。,3.,成年的健康,(,雄性和雌性未孕,),实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择,食品毒理学实验的局限性,WHO,在,临床前药物安全性实验原则,的文件中指出“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究，但给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。”这就是利用动物实验的局限性，,即动物实验的结果外推到人的不确定性,。,1.,物种差异的不确定,2.,高剂量向低剂量外推的不确定。,3.,小数量实验动物到大量人群外推的不确定。,4.,反应的易感性不确定,第二节 毒理学毒性评价试验的基本目的,毒性评价或安全性评价方面的基本目的包括以下几点：,1.,受试物毒作用的表现和性质。,2.,剂量,-,反应,(,效应,),研究。剂量,-,反应,(,效应,),研究是毒性评价和安全性评价的基础。,3.,确定毒作用的靶器官。,4.,确定损害的可逆性。,当然，毒理学研究还可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制研究、受试物的毒物动力学和代谢研究、中毒的解救措施等。,第三节 常用实验动物选择和处理,1.,常用实验动物特征,实验动物,(laboratory animals),：经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检验以及其他科学实验的动物。或者简单说以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。,实验动物种类,：常用的实验动物物种为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡、青蛙等。,2.,实验动物特点：,具有较小的个体差异，较强敏感性，较好的重复性与较一致的反应性。,一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科学界所公认。,3.,常用实验动物特征,常用实验动物生物学和生理学参数表,4,实验动物的选择和处理,4.1,选择,毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象，为获得可靠的研究结果，,先决条件,是正确地选用实验动物。,实验动物选择,原因,：,外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物之间表现不同，物种差别可以表现在量方面，引起毒性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，人对,138,种化学物的敏感性为大鼠的,1.8,10.5,倍。,物种差别也可以表现在质方面,(,毒性效应的差别,),，如除草剂百草枯对人引起肺损伤，而对狗则未见到。,4.2,实验动物的选择,选择原则,相似性原则,：选择结构、功能、代谢、群体分布、疾病状态方面与人类相似的物种。,差异性原则,：研究过程要求以差异为指标或特殊条件时，选用不同种系实验动物的某些特殊反应，更适合于不同研究目的的要求。例如人类利用不同种属动物对病原微生物的易感性差异来生产弱毒疫苗。,易化性原则,：进化程度高、结构功能复杂的动物有时会给实验条件控制或实验结果分析带来困难，则应从易化角度入手，选择既能满足实验要求，结构功能又简单，便于实验分析的动物。如反射弧的研究选择两栖动物；遗传学研究选择果蝇。,相容或相匹配原则,：设计动物实验时，选用的动物质量等级要与实验设计、实验条件、实验者技术、方法、试剂性能相匹配。,可获得性原则,：在不影响实验质量的前提下，选择最易获得、最经济、易饲养管理的动物。,重复性和均一性原则,：选用标准化的实验动物。杜绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物控制的非标准化动物。,4.2,实验动物的选择,选择方法,物种选择,物种选择的,基本原则,选择对受试物在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种；,自然寿命不太长的物种；,易于饲养和实验操作的物种；,经济并易于获得的物种。,目前常规选择物种的方式是利用两个物种，一种是,啮齿类,，另一种是,非啮齿类,。,系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗；,豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验；,兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验；,遗传毒理学试验多用小鼠；,致癌试验常用大鼠和小鼠；,致畸试验常用大鼠、小鼠和兔；,迟发性神经毒性试验常用母鸡。,品系选择,品系,(strain),是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。,实验动物按遗传学控制分类可分为：,近交系,：指同胞兄妹或亲子之间连续交配,20,代以上而培育的纯品系动物。一般近交,8,12,代的近交群没有实用价值，只有连续,20,代以后，群体基因才能达到纯合和基本稳定。,杂交群动物,(,杂交,1,代，,F1),，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。,封闭群,：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。,根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。,4.2,实验动物的选择,选择方法,4.2,实验动物的选择,选择方法,实验动物微生物控制的选择,按微生物控制分类，实验动物分为四级，如下表。对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用二级,(,或二级以上,),的动物，以保证实验结果的可靠性。,实验动物微生物等级,级 别,要 求,I,级,普通动物，应没有传染给人的疾病,级,清洁动物，除,I,级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病,级,无特定病原体动物,(SPF),，除,级标准外，动物为剖腹产或子宫切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不致病细菌丛，没有致病病原体,IV,级,无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带有任何微生物和寄生虫,(,包括绝大部分病毒,),5.2,实验动物的选择,选择方法,个体选择,实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。重点是,动物的性别、年龄、体重、生理状态和健康状况,。,一般来说，对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。,毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。,急性试验一般选用成年动物；,慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使实验周期能复盖成年期。,实际工作中常以动物的体重粗略地判断动物的年龄。,性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。,为确保选择健康动物，一般在实验前观察,5,7,天。,大、小鼠,根据形态鉴定日龄（大、小情况基本一样）,5.,实验动物的处理,1.,健康检疫,实验动物在购进之后，应雌雄分开饲养。一般应进行,5,7,天的检疫，在此期间应多次观察动物，及时剔除不健康的动物。,2.,实验动物的抓取和固定方法,3.,性别鉴定,4.,实验动物的编号和标记方法,实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸,(,黄色,),、品红,(,红色,),的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。,对啮齿动物还可用剪耳法标记。,对狗等大动物一般用挂牌法。,5.,实验动物被毛去除方法,剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）,6.,实验动物的麻醉,实验动物的抓取和固定方法,小鼠,用右手提起小鼠尾部，放在实验台上，当其向前爬行时，左手抓住两耳及头颈部皮肤，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夹住肢体固定。右手可行注射或其它操作。,大鼠,右手轻轻抓住大鼠尾部向后轻拉，左手抓紧鼠两耳及头颈部皮肤，并将其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。,兔,1,、可伤两肾；,2,、可造成皮下出血；,3,、可伤两耳；,4,、颈部皮肤厚可抓；,5,、用手拖住身体。,4,和,5,为正确的方法。,豚鼠,先用手掌以稳准的手法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指握住颈部，或握住身体的四周，再拿起来。怀孕或体重较大的豚鼠，应以另手托其臀部。,性别鉴定,对小鼠性别的鉴定主要是观察肛门与生殖器之间的距离。雄性大鼠的距离较大，雌性的距离较小。,实验动物的编号和标记方法,染色法,实验动物的编号和标记方法,耳朵标记方法,实验动物的麻醉,1,、操作台，,2,、固定架，,3,、固定螺钉，,4,、调节杆，,5,、调节螺钉，,6,、放大镜，,7,、麻醉固定罩，,8,、挡板，,9,、头部固定孔，,10,、压板，,11,、上肢固定夹，,12,、腹部固定夹，,13,、下肢固定夹。,6.,实验动物的染毒和处置,6.1,实验动物染毒,毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。,最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。,不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射其他途径,(,如经皮等,),。,1.,经口,(,胃肠道,),染毒,常用有喂饲、灌胃和吞咽胶囊等方式。,(1),喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。,优点：简单易行，符合人类接触受试物的实际情况。,缺点：如适口性差的受试物，动物拒食，摄入量达不到设计剂量；易挥发或易水解的受试物不适用。,实验动物应单笼喂饲，以食物消耗量计算其实际染毒剂量。,(2),灌胃：将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。,大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食,4,小时,(,因小鼠消化吸收和代谢速度较快,),，均不停饮水。灌胃后,2,4,小时提供饲料。,经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。,灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能,.,一般当灌胃针插入小鼠,3,4cm,，大鼠或豚鼠,4-6cm,后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为,0.2-1ml,，大鼠,1-4ml,，豚鼠为,1-5ml,。,狗、兔、猫、猴灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定,(3),吞咽胶囊：将一定剂量的受试物装入胶囊中，放至动物的舌后部，迫使动物咽下，此法剂量准确，适用于易挥发、易水解和有异味的受试物。缺点是动物有咬伤人的危险。,2.,经呼吸道染毒,经呼吸道染毒可分为吸入染毒和气管内注入。,(1),静式吸入染毒：将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的液态受试物或气态受试物使成一定浓度。,染毒简易；,但缺点较多，主要是随试验进行氧分压降低,(,因此，实验动物数量有限制,),，柜内受试物浓度也逐渐下降,(,由于动物吸入消耗、为被毛及染毒柜壁吸附所致,),，而且实验动物有经皮吸收的可能。,(2),动式吸入染毒：由染毒柜、机械通风系统和配气系统三部分构成。,优点是在染毒过程中染毒柜内氧分压及受试物浓度较稳定；,缺点是消耗受试物的量大，并易于污染环境。,动式吸入染毒又分为整体接触和口鼻接触两种。,动式吸入染毒柜中受试物的浓度应实际监测,。,(3),气管内注入：实验动物在麻醉后，将受试物注入气管，使之分布至两肺。此法用于建立急性中毒模型及尘肺研究。,3.,经皮肤染毒,将受试动物皮肤表面涂抹一定量的受试物，再用纱布和塑料薄膜盖上，用胶布固定，接触规定的时间。,经皮肤染毒的目的有两种。,一种是经皮染毒毒性试验，如经皮,LD,50,测定常用大鼠，皮肤致癌试验常用小鼠。,另一种是皮肤刺激和致敏试验，皮肤刺激试验常用兔和豚鼠，皮肤致敏试验用豚鼠。,4.,注射染毒,分为皮内注射、皮下注射、腹腔注射、肌内注射和静脉注射。,对大小鼠可用静脉注射，非啮齿类可模拟临床用药途径，如狗可用后肢隐静脉注射，而啮齿类的尾静脉和肌肉注射难以多次染毒，必要时可改为皮下注射。,静脉注射应控制速度，大鼠尾静脉注射最好控制在,10,秒以上。,注射染毒应调整受试物的,pH,及渗透压，,pH,应,5,8,，最好是等渗溶液，动物对高渗的耐受力比低渗强。,腹腔注射在遗传毒理学实验中有时也用，但在致畸试验、肝,UDS,研究不应该用腹腔注射，以避免可能的损伤和局部高浓度对靶器官的影响。,小鼠腹腔注射方法,家兔耳缘静脉注射方法,小鼠尾静脉注射方法,狗前肢头静脉注射,狗后肢小隐静脉注射,蛙腹壁静脉注射,6.2,实验动物处置,(1),生物标本采集,在实验过程中常需要对生物样品如血液、尿液、胆汁、粪便等进行检测或检查，它们是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最重要途径。,血液采集,大小鼠如需血量小可用,鼠尾采血,，如需血量较多可用,眼眶静脉丛采血,或处死时,股动脉放血采血,。,狗可用,后肢隐静脉抽血,。,不影响动物生理功能的最大取血量为其总血量,(50ml/kg,体重,),的,10,。,最大安全采血量与最小致死采血量,尿液采集,对大小鼠可用,代谢笼法,，下部有粪尿分离器。,对狗可用,接尿法,或,导尿法,。,胆汁采集,直接插管至胆总管采集,粪便采集,对大小鼠可用,代谢笼法,，下部有粪尿分离器，分析前剔去表层。,(2),安死术及其操作方法,安死术是指用公众认可的、以人道主义的方法处死动物的过程，即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡。,安死方法最重要的标准是应具有保证动物中枢神经系统立即大道失去痛觉的早期抑制作用。应尽量采用适当的处死方法，减少实验动物的痛苦。,大小鼠可用颈椎脱臼法（脊髓与脑髓拉断），然后股动脉放血，动物立即死亡。,兔、豚鼠、狗等一般用股动脉放血处死，或向静脉内注射一定量的空气使之发生严重的血液循环障碍的空气栓塞法。,化学药物致死法均适合。,(3),病理解剖和标本留取,毒性病理学检查包括大体解剖和组织病理学检查两部分。急性毒性试验中在试验期中死亡或试验结束处死的动物都应进行尸体解剖，因为急性毒性试验的目的是得到有关可能的靶器官信息以及进行重复染毒试验剂量设计的信息。,第四节 食品毒理学试验的设计原则,试验设计,(experimental design),是指为试验研究制定出一个通盘的、周密的、安排合理的、科学性强的设计方案，将试验对象随机分配到两个或多个组中，对试验对象施加某种干预或处理因素，观察比较不同处理的效应。,食品毒理学试验包括体内试验和体外试验两种。,体内试验是以实验动物为模型，通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。,体外试验则主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。,毒理学实验能否获得预期结果，试验前的试验设计至关重要。,科研设计遵循的三原则：随机、重复、对照,。,1,体外试验设计,1,溶剂,/,赋形剂,所用溶剂,/,赋形剂不应与受试物发生化学反应。推荐使用谁作溶剂,/,赋形剂。,2,受试物,了解受试物各方面性质，测定受试物在试验介质中的溶解性。溶解性限度就是出现沉淀的最低浓度。,3,受试对象,4,剂量设置,5,代谢活化,代谢活化系统的选择和条件依赖于受试物的类别。,6,对照,未处理（空白）对照、阳性对照、阴性对照,7,重复,由质控良好的实验得到明确的阴性结果和阳性结果，不强调要求重复。可疑结果则应重复实验。,2,体内毒理学试验设计,1,实验动物,动物选择，首选实验动物是其对受试物的代谢过程、生理反应和生化特性基本上与人接近的。,动物数量，各组各组动物数的设计应考虑到统计学的要求。,2,受试物,资料、处置、给予方式,3,对照,对照条件,对照类型,未处理（空白）对照（必要时设）,：对照组不施加任何处理因素，不给受试物也不给以相应的操作。,阳性对照（必须设）,：用已知的阳性物,(,如致突变物,),检测试验体系的有效性。如在遗传毒理学试验、致畸试验和致癌试验中用已知的致突变物、致畸物或致癌物染毒，应该得到肯定的阳性结果,(,即致突变性、致畸性或致癌性,),。,阴性对照（尽可能设）,：不给处理因素但给以必须的实验因素,(,溶剂赋形剂,),，以排除此实验因素,(,溶剂赋形剂,),的影响。没有阴性对照组就不能说明受试物染毒与有害作用之间的关系。,历史性对照,：由本实验室过去多次实验的对照组数据组成。,4,剂量分组,一般至少要设,3,个剂量组,(,即高剂量组、中剂量组、低剂量组,),。,一般要求，高剂量组应出现明确的有害作用，或者高剂量组剂量已达到染毒的极限剂量,(,如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量,),。,低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用,(,即相当于,NOAEL),，但低剂量组剂量应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量。,中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间，应出现轻微的毒性效应,(,即相当于,LOAEL),。,5,观察指标,指标的有效性、客观性、准确度和精密度、灵敏度、特异性、选择指标的数目、指标的标准化,6,试验期限,某些试验,(,如致畸试验和多代生殖试验,),的试验期限是由受试实验动物物种或品系而决定的。而其他毒性试验的期限在某种程度上由定义所决定。,7,试验设计常用方法,完全随机设计,配对设计,随机区组设计,析因设计,拉丁方设计,第五节 毒理学实验结果处理和分析,在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。统计检验的假设是关于总体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是绝对的肯定或否定，不等同于有或无生物学意义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该根据统计学分析的结果、生物学知识和经验,。,1.,毒理学研究的数据类型,计量资料,通过对观察单位用定量的办法测量某项指标数量大小所得到的资料。如动物身长、体重、血红蛋白量、进食量等。,分类资料,将观察单位按某物种性别或类别分组，然后庆典各组的观察单位数目所得到的资料，如实验动物的性别分雌雄，实验结果分阳性、阴性等。,等级资料,将观察单位按某种属性的不同程度分组，统计各组的观察单位数目所得到的资料。如效果判定为显效、有效、无效；程度分轻、中、重；实验室检测结果分、,、 、 等。,2,假设检验的一般考虑,实验和观察的单位,处理组间进行比较的形式,假设检验和概率值,3,数据处理和统计方法,(1),处理组与阴性对照组比较,(2),剂量,-,效应关系和剂量,-,反应关系,(3)IPCS,推荐的统计学分析方法,(4),常规毒理学试验资料推荐的统计学方法,4.,统计学意义和生物学意义,在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义。,一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。,正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。,.,.,生物学意义（即生物学重要性）的判断,在判断生物学意义,(,即生物学重要性,),时，可考虑以下步骤。,(1),纵向比较,：此参数的改变有无剂量,-,反应关系。化学物毒作用的剂量,-,反应关系是毒理学研究的基本假设。当某参数的改变存在阳性剂量,-,反应关系，就可认为此参数的改变与受试物染毒有关，具有生物学意义。,(2),横向比较：,此参数的改变是否伴有其他相关参数的改变。如没有骨髓或脾组织学改变或没有高铁血红蛋白生成，则单有红细胞计数的改变是没有生物学意义的。同样，在免疫毒理学中，单有淋巴细胞计数的改变不伴有淋巴结组织学改变也可能是没有生物学意义的。,(3),与历史性对照比较：,目前尚无公认的实验动物参考“正常”值，应由本实验室利用相同品系的实验动物和相同的溶剂，进行至少,10,次独立实验的阴性,(,溶剂,),对照的资料构成。,在分析和综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义时，可能遇到四种情况。见下表所示。在此表中，第,和第,种情况最为常见，第,种情况是无统计学意义也无生物学意义，第,种情况是有统计学意义也有生物学意义。但是有时在实验结果中会出现第,和第,种情况。,毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义,生物学意义,统计学意义,无,有,无,有,第,种情况是具有生物学意义但无统计学意义，这可能是因为该事件的发生是极端罕见的，例如在哺乳动物致癌试验中，在染毒组中出现对照组中没有的肿瘤类型，尽管从统计学上此种肿瘤的发生率很低，与对照组比较差别无显著性,(P0.05),，但还应该认为是有生物学意义的。,第,种情况是有统计学意义但无生物学意义，例如在某个亚慢性毒性试验中，中剂量组动物血液白细胞计数低于阴性对照组，差别有显著性,(P0.05),。由于在此实验结果中未出现剂量,-,反应关系，因此中剂量组血液白细胞计数降低可能是由于偶然因素造成的，没有生物学意义。在判断实验结果的生物学意义时，有无剂量,-,反应关系是关键。有统计学意义但无生物学意义的情况，更常见的是因为实验设计和实施不良所致。,