生物制药工艺学实验1

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2022/4/28/Thursday,#,生物制药工艺学实验,从蛋清中提取溶菌酶,实验流程,柱层析前的准备工作,离子交换层析法从蛋清中初步提取溶菌酶,超滤法进一步分离纯化溶菌酶和盐析法浓缩、透析法除盐,SDS-PAGE,法检测溶菌酶的纯度,测定溶菌酶的活力和冷冻干燥溶菌酶,实验一、柱层析前的准备工作,实验目的：,掌握离子交换树脂预处理的方法；,掌握离子交换层析柱装填的方法。,实验材料,树脂：,724,型阳离子交换树脂,层析柱,:,1.6cm30cm,溶液：,0.1M NaOH,，,0.1M,HCl,其他材料：,布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等,实验原理,离子交换树脂及其预处理,离子交换层析系统的组装,离子交换层析的参数,背景知识,离子交换树脂结构,骨架：,接有功能基团，本身是惰性,功能基团：,连接在骨架上，可与相反离子结合,活性离子：,与功能基团所带电荷相反的可移动的离子,待交换分子：,在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合,实验原理,724,型阳离子交换树脂,骨架：,丙烯酸型；,功能基团：,羧基；,pK,4.5,；,适用的,pH,范围：,pH5,14,；,系弱酸性阳离子交换剂，所以,交换容量随缓冲液,pH,值的变化而变化，,pH,7,时，交换容量是,8.0mmol/g,；,Na,型树脂比,H,型树脂更容易与溶菌酶进行交换。,树脂的预处理,物理处理：,水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；,化学处理：,阳离子树脂 酸,碱,酸（氢型）； 碱,酸,碱（钠型）,树脂的再生,钠型阳树脂可用,23M NaCl,溶液再生；,氢型阳树脂用强酸再生，如盐酸。,若有强吸附物则可用,0.1N NaOH,溶液洗树脂；若有脂溶性物质则可先用非离子型去污剂或者乙醇洗树脂然后再生。,转型：,树脂在去杂后，为了发挥其交换性能，按照使用要求人为地赋予活性离子的过程。,弱酸或者弱碱性树脂：,用碱（,NaOH,）或者酸（,HCl,）转型；,强酸或者强碱性树脂：,除了碱、酸还可用,NaCl,溶液转型。,层析的装置,层析的参数,柱床体积：,离子交换树脂装柱后，从柱的底,板到树脂沉积表面的体积。,计算方法：,柱床体积横截面积,高度,实验内容,预处理,724,型阳离子交换树脂,装填层析柱,配制磷酸钠缓冲液,平衡离子交换树脂,预处理,724,型阳离子交换树脂,碱酸碱的方法（,Na,型）,每次用,0.1N,NaOH,或者,0.1N HCl,溶液,（体积约为树脂的,23,倍）浸泡树脂,1015min,后，都要用蒸馏水将碱液、酸,液冲洗掉。,实验步骤,实验步骤,装填离子交换层析柱（重力沉降法）,固定层析柱，保持层析柱,垂直,；,将蒸馏水倒入层析柱中，以,排出管道中的空气,，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；,用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂,自然沉降,，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约,2cm,。,注意事项：,严防树脂中出现断层、气泡；,保持树脂浸于蒸馏水中、不能干涸；,保持树脂表面水平，不被蒸馏水扰动,实验步骤,配制,0.1M,磷酸钠缓冲液,pH7.0,先配制,1M Na,2,HPO,4,57.7mL,1M NaH,2,PO,4,42.3mL,将两者混合后稀释至,1000mL,，装于试,剂瓶中。,实验步骤,平衡离子交换树脂,0.1M,磷酸钠缓冲液,恒速缓慢,流经树脂，,直至流出液的,pH,值与缓冲液相同，平衡,结束。,1,、请第一组同学留下来打扫卫生。,2,、各组同学清洗各自的玻璃器皿，收拾打扫自己的台面。,