组织培养育苗

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物组织培养,1,植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株，统称为植物组织培养。,组织培养育苗,2,3,植物组织培养流程图,4,获取,外植体,无菌接种,诱导愈伤组织,的形成,试管苗的形成,扩大培养,移栽,脱分化,再分化,培养基,配制,组织培养步骤,5,植物组织培养的过程,可概括为：,脱分化,再分化,根、茎、叶,外植体 愈伤组织,或,完整植物,胚状体,茎尖、茎段、胚及子房等,器官做外植体可不经脱分化直接形成试管苗。,6,植物组织培养原理：,一是细胞的全能性；二是再生作用，与植物体分离的器官具有恢复完整植株的能力。,组织培养类型：,愈伤组织培养、器官培养、茎尖培养、原生质体培养、悬浮细胞培养。如花药培养：培养离体花药易获得单倍体植物。,7,8,1.无菌操作室,缓冲室（间）：,接种室（间）：,8,组织培养准备实验室,9,缓冲室,10,培养室,11,无菌室（一）,12,无菌室（二）,13,二、仪器与设备,1、基本设备,冰箱、电炉、酸度计、纯水器、天平、培养基分装器、搅拌器等。,14,15,常用仪器和设备,15,冰箱,酸度计,电炉,16,天平,纯水器,17,培养基分装器,搅拌器,18,19,培养室,19,2、灭菌设备,蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。,20,高压蒸汽灭菌器,21,21,22,3.,组培实验室的基本设备,器皿和器械类,玻璃器皿,器械,镊子类,解剖刀,剪刀,接种针,细菌过滤器,22,4.,仪器设备,无菌操作设备,超净工作台,23,23,3、无菌操作设备,超净工作台,24,无菌接种箱,25,电热烘箱,接种器具消毒器,26,26,27,5.,培养设备,空调,加湿器和去湿机,定时器,培养架,摇床或旋转床,培养箱,27,蒸汽压力灭菌锅,28,干热消毒柜,29,无菌瓶顶过滤装置,喷雾消毒器,（参考图）,（参考图）,30,6,、细胞培养设备,摇 床,31,培养架,32,HZC-250恒温振荡培养箱,150C250D光照培养箱,33,7,、细胞学鉴定设备,光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜,倒置显微镜,光学显微镜,34,1、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,35,2、金属材质用具,镊子,解剖刀,接种针,36,温室,37,37,38,培 养 室,准 备 室,灭菌室,储藏室,接种室,缓冲室,植物组织培养实验室布局示意图,38,药品贮存和配制仪器设备,冰箱,天平,酸度计,观察分析仪器设备,体视显微镜,普通光学显微镜,倒置显微镜,其它仪器设备,离心机,恒温水浴锅,39,39,40,一、培养基,组培中培养基的重要性：,基本培养基：,指只含有维持离体植物细胞基本生命活动所需的营养成分的培养基。通常包括水分、无机营养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加物。,完全培养基：,指在基本培养基的基础上另外附加激素或天然有机附加物所组成的培养基。,40,优化培养基 无蔗糖 1%蔗糖 5%蔗糖,无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无NAA,非洲紫罗兰叶片培养,41,固体培养：,液体培养,42,43,1、 培养基的构成,水,无机盐类,大量元素化合物,微量元素化合物,有机营养成分,糖类,维生素类,氨基酸类,43,硼,与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系,铜,是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长,锰,参与植物的光合、呼吸代谢,钼,参与氮素的代谢,氯,是光合作用水光解的活化剂,微量元素的主要作用是作为,酶的辅助因子或激活剂,参与代谢的调节。,44,缺铁,症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,45,缺铜,症状：,新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。,枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,46,缺锰,典型症状：,叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,47,缺钼,典型症状：,叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。,十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,48,缺硼,典型症状：,受精不良,籽粒减少 ，“花而不实”， “蕾而不花”；,根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；,常引起各种腐烂病。,马铃薯,49,50,植物生长调节剂,1、生长素类,常用类型：,NAA,2,4-D,IBA,IAA,功能,培养基中常用浓度：10,-7,10,-5,mol/L,或,0.110,mg/L,50,2、细胞分裂素类,常用类型：,6-BA,KT.TDZ,2-ip,功能,培养基中常用浓度： 10,-7,10,-5,mol/L,或0.110,mg/L,51,51,52,3、组织培养时，植物激素的使用规律,在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下：, 先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化,容易产生多倍体细胞。,52, 先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。, 用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向：,生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。,53,53,54,天然有机添加物质,椰汁：,CM,100150ml/L,酵母提取液：,YE,0.01%0.5%,番茄汁：5% 10%,马铃薯汁：100g/L 200g/L,香蕉泥（汁）：150mg/L 200mg/L,54,55,培养基的配制,1、基本培养基母液的配制, 单配法, 混配法,按照避免难溶性沉淀形成的原则和物质种类的不同，将基本培养基配方所包括的物质进行分组；,55,56,基本培养基配方中物质划分组数的多少，即配制母液数的多少可根据实际情况而定，如MS培养基可以配制三液式、四液式、五液式等；,例如：MS培养基五液式,大量元素母液,钙盐母液,微量元素母液,铁盐母液,有机营养成分母液,56,57,培养基的配制,水,准备 母液 混合定容 调pH 加入琼脂,糖,加热溶解,培养器皿 清洗 干燥 分装 封口,高压蒸汽灭菌 冷却 凝固 接种,培养基具体配制操作过程：,P,21,培 养 基 配 制 程 序,57,58,组培实验基本操作技术,器皿和器具的洗涤,P,19,1.洗涤剂：,无磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗洁精,2.常用清洗方法,洗涤剂清洗法,超声波清洗法,3.玻璃器皿的清洗,新购置的玻璃器皿的清洗,用过的培养器皿的清洗,已经污染的玻璃器皿的清洗,58,59,二、灭菌,器具的灭菌方法,干热灭菌法,高压蒸汽灭菌法（湿热灭菌法）,火焰灼烧灭菌法,培养基的灭菌方法,高温蒸汽灭菌法,过滤除菌法,59,60,培养基灭菌方法,-湿热灭菌法,培养基湿热灭菌最少时间,液体容积（ml） 121所需时间（min）,20-50 15,75 20,250-500 25,1000 30,1500-2000 35-40,60,61,培养基高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）操作,P,20,灭菌后培养基的存放：,锅内加水,放入消毒桶,装入培养基,盖好锅盖,接通电源加热,排尽锅内冷空气,达到灭菌温度时开始计时并保持足够长的时间,继续加热,切断电源,压力表指针归零时打开锅盖,取出培养基并存放好,61,62,高压蒸汽灭菌锅安全使用注意事项：, 灭菌前外层锅内要加入足够的水,灭菌完成后要将锅内的水排放干净。, 在灭菌过程中及灭菌后，压力表压力指针归零之前,不能打开锅盖,以免发生危险。, 注意日常维护和检查,及时发现问题,及时修理，保证使用安全可靠。,62,63,使用高压蒸汽灭菌锅进行物品灭菌时的注意事项：, 消毒锅内放置的物品要有一定的缝隙，便于高温蒸汽上下回流，达到良好灭菌效果。, 锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到相应的温度，因而影响灭菌效果。, 进行培养基灭菌时，锅内达到规定的灭菌温度后，在严格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短则达不到灭菌效果。,63,无菌操作室内的灭菌方法,熏蒸灭菌法,射线灭菌法,外植体的表面灭菌,P,29,化学消毒剂灭菌法,抗生素抑菌法,64,64,65,1.外植体灭菌的常用杀菌剂,良好的外植体灭菌效果的含义：,外植体灭菌后无菌率高，同时植物细胞不会受损伤或只是轻微受损伤而能保持正常生长。,65,66,2.外植体表面灭菌,外植体表面灭菌操作前的准备工作：, 无菌水、漂洗瓶、切割用器皿（玻璃培养皿或不锈钢切割盘）和金属器具均经过高温高压灭菌并整齐摆放在超净工作台上。, 灭菌剂配制好并整齐摆放在超净工作台上。,66,67,67,68,外植体表面灭菌的一般过程,预处理：,外植体取材,备用,无菌水充分漂洗,3,5,次,无菌条件下，消毒剂处理,无菌条件下，,70%,酒精表面消毒,30S,60S,预处理,68,69,3.影响外植体消毒效果的因素：,消毒剂种类,消毒剂使用浓度,消毒处理时间,4.培养过程中污染原因及对策,污染的病原类型,污染发生原因,防污染对策,69,70,三、,外植体的接种,1 定义,2 外植体接种操作前的准备工作,接种室的清洁和灭菌,超净工作台的清洁和灭菌准备,操作人员无菌操作前的准备,3 外植体接种的具体步骤,切割外植体,培养瓶倾斜靠近酒精灯火焰,瓶盖外部在火焰上旋转灼烧数秒钟,旋开瓶盖，扣放在酒精灯旁边,瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟,用无菌镊子将外植体均匀放置在培养基上,瓶盖在火焰上灼烧两圈,盖紧瓶盖,70,71,组织培养繁殖,72,初代培养：,芽、茎段、叶片、,花器等外植体在,离体培养条件下,诱导愈伤组织、,侧芽或不定芽、,胚状体过程,73,对应于种子胚而言。在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构,。,胚状体,embroid：,石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程,74,继代培养：,更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。,继代培养一般使用固体培养，采取分株、切割嫩茎等方法进行扩大培养。,75,生根培养：,当试管苗增殖到一定数量时要进行生根培养。配制生根培养基，即1/2MS+生长素。,将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。,76,驯化移栽：,组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应 露地或保护地条件的过程,。,77,78,78,79,79,80,80,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,81,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,82,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,83,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,正 确 错 误,84,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,正 确 错 误,85,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,86,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,87,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,88,茎段培养成苗示意图,89,花烛叶片离体快速繁殖,90,胡萝卜形成层(分生组织)培养示意图,91,台湾百合离体培养,92,大蒜愈伤组织培养,93,94,直接器官发生 间接器官发生,体细胞胚胎发生,95,败育,胚培养,96,97,2,离体培养体系的建立,供体植物材料的确定,外植体的选择,外植体的灭菌,外植体的培养,外植体的接种,97,98,常用外植体的种类,茎尖,带节茎段,节间部茎段,叶片和叶柄,鳞片,98,生长素的生理作用,1、促进细胞生长和细胞分裂2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力3、形成愈伤组织，促进生根4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。,99,1、生长素类：,1）吲哚类：IAA（吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类： NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-T,P,（ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。,其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。,100,A：NAA 0mg/L，芽（少），根（无）,B：NAA 0.1mg/L，芽（少），根（无），愈伤组织（少量） C：NAA 5.0mg/L，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量,A B C,101,2、细胞分裂素,是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6苄基氨基嘌呤。,功能：,1、促进细胞的分裂和分化,2、诱导芽的分化,3、促进侧芽的萌发和生长,4、抑制衰老,102,A B,A：BA(0mg/L) ，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）,103,控制植物细胞分化,分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件,比例高时产生芽,比例低时产生根,104,生理作用：,1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入,3,、赤霉素（,GA,3,）,105,生理作用,：1、抑制蛋白质的合成2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用3、诱导休眠、促进衰老和脱落,4,、脱落酸（,ABA,）,106,以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用ppm表示 1ppm=1mg/L,107,1、固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养） 琼脂的用量一般在4-10g/L，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。2、悬浮剂Ficoll（聚蔗糖）,（四）固化剂和悬浮剂,108,109,外植体的培养条件,温度,光照,湿度,培养基的营养物质和pH变化,培养物的气体环境,109,（,六,）试管苗移栽,试管苗移栽前须放在常温下的室内进行炼苗4-7天，使试管苗逐渐适应外界环境。,移栽前1-2天打开瓶盖。,移栽基质：河沙、至石、珍珠岩或砂加园土（1：2）。,移栽前基质用杀菌剂进行消毒，并洗去苗基部粘着的培养，然后进行移栽。,移栽完后要经常浇水，保持空气湿度90%以上，并遮光50%，一周后施一次营养液，如MS，0.1%尿素水等。,待长出新叶后追施速效性肥，并可上盘。,110,驯化移栽：,组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应 露地或保护地条件的过程,。,111,