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,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,Cliquez pour modifier le style du titre du masque,Cliquez pour modifier les styles du texte du masque,Deuxime niveau,Troisime niveau,Quatrime niveau,Cinquime niveau,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,李宁,青岛大学医学院,生化教研室,Golgi apparatus (red,）,Endoplasmic Reticulum,Mitochondria,Peroxosomes(green,),第一章,蛋白质分子的,折叠和定位,在细胞内核糖体上合成的多肽链是如何,折叠,成三级结构的？它们又是如何形成四级结构的？每个蛋白质分子只有在特定的细胞部位才能发挥功能。不同的蛋白质是如何进行,定位,的,？这是,本章重点讨论的问题。,第一,节,蛋白质分子的折叠,一、蛋白质折叠问题,一条从核糖体上合成的具有特定序列的多肽链是怎样折叠成具有特定空间结构的蛋白质，即天然构象的？是目前,尚未解决,的一个重大课题。如果肽链折叠发生异常，不仅不能发挥正常的生物学功能而且必然导致蛋白质的聚集而引起疾病。,镰刀形细胞贫血病,疯牛病,-,朊病毒,20世纪60年代，Anfinsen根据牛胰核糖核酸酶,体外,的变性与复性,的实验结果，提出了蛋白质的一级结构决定了蛋白质的空间结构和生物学功能，即蛋白质在体外的折叠是自发进行的。,对细胞内新生肽链折叠的机制而言，必须解决下列问题：,1、体内新生肽链的折叠是否也是自发进行的？,2、一级结构与空间结构中间是否存在一对一的折叠密码关系呢？怎样破译？,3、新生肽链的折叠是何时开始的，是伴翻译过程还是翻译后过程？,（一）、,从热力学角度研究蛋白质折叠,从热力学角度讲，蛋白质之所以能自发折叠是因为体系的自由能降低，天然构象是能量最低的,状态。,“自组装”热力学假说：,蛋白质一级结构决定高级结构,通过非共价键,折叠好的蛋白质使自由能下降，但下降不会太大，,一般介于10-50kJ mol,-1,。这也是绝大多数蛋白质不稳定的原因。,但有些,特殊,蛋白质相当稳定，这类蛋白质分子折叠的热力学特征值得研究。,（,二,）、,从动力学角度研究蛋白质折叠,蛋白,质折叠的动力学悖论,：,不是随机的,而是受动力学控制,蛋白质折叠的动力学学说：,动力学,折叠中间体 折叠中间体。天然构象,二硫键重排、辅氨酰顺反异构化,（,三,）、,能级形貌理论和谐诠释蛋白质折叠,蛋白质各分子沿各自途径折叠，由分子构象松散、自由能大的状态经过构象塌陷、表面张力或疏水作用形成紧凑结构，最终形成自由能最小、构象熵最小、热力学最稳定的、唯一的天然构象。,二、折叠模型,成核,-,快速生长模型,拼图模型,框架模型,快速疏水垮塌模型,扩散,-,碰撞,-,缔合模型,动力学模型,格点模型,成核,-,快速生长模型,拼图模型,框架模型,快速疏水垮塌模型,扩散,-,碰撞,-,缔合模型,动力学模型,三、蛋白质折叠受内在因素外部条件制约,1,、氨基酸侧链,疏水性氨基酸残基：疏水核,亲水性氨基酸残基：氢键,2,、二硫键形成是蛋白质折叠的限速步骤,脯氨酸顺反异构化是抑制蛋白质折叠的潜在因素,3,、,-,螺旋形成的起始阶段是个慢过程,4,、单个结构域独立折叠,（一）,内在因素：氨基酸侧链和肽链的二级结构,（二）,外部条件：细胞内的特殊环境,细胞内的大分子拥挤效应,温度和,PH,影响带电状态,金属离子的配位效应,金属配位键,体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的差别,四,、蛋白质折叠需要其他辅助因子,蛋白质在体内的折叠相当迅速，如果不迅速折叠，蛋白质分子会被降解，或者形成无活性的,聚集体。,蛋白质肽链折叠可能是与翻译过程同时进行，也可能多肽链翻译过程结束之后。最近研究表明,:,在,原核细胞中，折叠似乎是在翻译完成之后再进行的；而在真核细胞中，折叠似乎是与翻译同步进行的。,分子伴侣蛋白,帮助正确折叠成中间折叠体，阻止和纠正不正确折叠,折叠酶,催化与折叠直接有关的化学反应,分子内分子伴侣,蛋白质分子内部的前导肽,细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助,-,即,分子伴侣（,chaperone,）,。,分子伴侣的作用,是可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。也促进二硫键的正确形成。,（一）分子伴侣蛋白,最主要的辅助因子,大量的研究表明很多在胁迫条件（如热激或缺氧等）下被诱导产生的所谓,“,胁迫诱导蛋白,(stress-induced proteins),”,或,“,热休克蛋白,(heat shock proteins,简写为,HSP,”,都具有分子伴侣活性,。,核质素,触发因子 （,trigger factor,，,TF,）,内质网中的,(,calnexin,、,Bip,、,Grp94,）,定义,：分子伴侣是指一类在序列上没有相关性但有共同功能 的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份，分子伴侣本身不包括控制正确折叠所需的构象信息，但是能阻止非天然态多肽链的错误折叠或凝集，给处在折叠中间体的多肽链提供更多正确折叠的机会。,1,、热激蛋白,HSP70,和,HSP40,以,ATP,依赖方式参与折叠,大肠杆菌中同源蛋白,DnaK,需要辅伴侣（,DnaJ,、,GrpE,）,生物学功能：,依赖于,ATP,的方式结合和释放非天然构象多肽的疏水片段，并能通过遮蔽这些片段而稳定蛋白质的松弛构象和阻止聚集 。,蛋白的跨膜运输,：,多肽链在跨膜运输前通常处于松弛构象状态，当多肽的前导链通过蛋白质通道进入线粒体内腔时，基质中的一分子,HSP70,立即与多肽上适当片段结合，防止其后退滑回细胞质，拖拽前导链促进整个蛋白质进入线粒体,2,、分子伴侣素,HSP60,和,HSP10,形成圆筒状复合体,辅助蛋白折叠，原核同源物为,GroEL,和,GroES,.,3,、触发因子（,trigger factor,，,TF,）是与核糖体,结合的分子伴侣,识别新生肽链疏水性氨基酸序列，形成新生肽链结合复合物（,NAC,）,使延长中的肽链不会过早折叠,分子伴侣功能：,阻止新生肽链的不正常聚集,阻止胁迫条件下的蛋白质分子聚集,帮助寡聚体蛋白质的组装,帮助蛋白质分子的跨膜转运,使聚集的蛋白质分子解散,使蛋白质分子维持一定的构象,分子伴侣与酶,（,二）折叠酶,二硫键异构酶,（,protein disulfide,isomerase,，,PDI,）,分子伴侣活性与酶活性部位无关,与底物的结合是瞬间的，通过反复的快速结合,-,解离阻止新生肽链的聚合或错误折叠,释放底物不需要,ATP,肽,基,-脯氨酰顺反异构酶,(,peptidyl,prolyl,cis,-trans,isomerase,，,PPI,),功能：帮助脯氨酸弯折处形成正确折叠,分类：亲环蛋白,FK560,结合蛋白,细蛋白,作用机理：催化,Xaa,-Pro,键的顺反异构体之间的转换,（三）分子内分子伴侣（,intromolecular,chaperone,，,IMC,）,具有前导肽（,pro,肽）的蛋白质的前体形式,直接将酶和底物连接在一起，将催化反应变成一个分子内反应,释放底物不需要,ATP,分两类：,参与肽链的延伸和正确折叠,枯草杆菌素、,水解蛋白酶,参与蛋白质在胞内的转运和定位,生长抑素,、髓过氧化物酶,（四）,五,、膜蛋白的折叠问题,膜蛋白的折叠研究,比较,困难，目前只有少数几个膜蛋白能成功地在体外进行变性与复性。,蛋白质在膜内疏水环境中的二级结构或者全部是,-,螺旋结构,，或者全部是,-,片层结构。,（一）,根据细菌视紫红质蛋白的研究结果提出了这种,-螺旋跨膜结构蛋白折叠的,“二阶段模型（two-stage model,）”：先形成一个-螺旋核心，其他-螺旋再通过螺旋-螺旋相互作用而结合到核心结构上去。,对于只是部分插入到膜中的外周膜蛋白的折叠，,一般认为在插入之前，蛋白质分子要进行部分折叠。,易位子,不仅参与蛋白质的跨膜转运，也参与协助膜蛋白的折叠。,（二）膜蛋白在膜中的二级结构也可以全部是,-,片层结构,多为通道蛋白，由信号肽引导，以成熟的蛋白形式分泌到细胞质中，然后插入到膜中。,第二节,蛋白质的定位,蛋白质的靶向输送,(,protein targeting),蛋白质,合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,一,、蛋白质,分子携带有不同,的定位信号,所有靶向输送的蛋白质结构中存在,分选信号,，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 亦称信号肽。,对于分泌蛋白质来讲，信号序列位于N端；对于非分泌蛋白质来讲，信号序列可位于肽链的N端、中间或C端。信号序列不都是肽链中短暂存在的，有的信号序列永久存在于蛋白质分子中,。,20,世纪,70,年代，,Blobel,提出了“信号肽假说”，该学说,认为，每一种蛋白质在真核细胞器中的定位是通过新生,肽链中短暂存在的信号序列协助完成的，这种信号首先,在分泌蛋白的,N,末端发现，该信号序列能被胞质中的信,号肽识别颗粒（,SRP,）识别与结合，然后将正在合成中的,“分泌蛋白质”带到内质网腔中，之后，信号肽被特异的肽,酶切去，“分泌蛋白”在内质网腔中经过折叠、组装和修饰,后被经由高尔基体输送到细胞外面、溶酶体中、内质网,腔、高尔基体腔、整合到这些细胞器的膜上、或是细胞,质膜上。,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1999,Gnter Blobel,1971,P,roteins have intrinsic topogenic signals,govern their transport and localization in the cell,Signal/,Translocase,/Energy,(,一）,、线粒体蛋白的定位,1,、线粒体蛋白质,N,端,带有定位信号,90%,以上的线粒蛋白前体在胞液合成后输入线粒体,基质、内膜,、,膜间腔或外膜,。,基质和内膜,蛋白只具有,基质靶向序列,。,膜间腔蛋白除了该序列之外还有,膜间质靶向序列,。,外膜,蛋白,除了该序列之外还有,停止转运,和,外膜定位序列,二、不同的定位信号引导蛋白质转运到不同的细胞部位,线粒体基质导入序列的特点是：,多位于肽链的,N,端,富含带正电荷的氨基酸,对所牵引的蛋白质没有特异性要求，非线粒体蛋白连接上此类信号序列，也会被转运到线粒体。,信号序列,定位,转运装置,信号序列位置,位于,N,端，富含带正电荷的氨基酸，形成两性,螺旋，完成转运后被切除。,基质靶向序列,基质,及,内膜,TOM,TIM,柠檬酸合酶,细胞色素,C,氧化酶,含疏水性的停止转移序列，被安插到外膜。,不被切除,，,基质靶向序列,+,停止转运和外膜定位序列,外膜,TOM,外膜孔道蛋白,含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入膜间隙，后被切除。,基质靶向序列,+,膜,间质靶向序列,膜间质,TOM,TIM,细胞色素,C,线粒体的蛋白转运装置,TOM,和,TIM,复合体,TOM,复合体（外膜转运酶复合体）,负责,通过外膜，进入膜间隙，,TIM,复合体（内膜转运酶复合体）,负责将蛋白质转运到基质，也可将某些蛋白质安插在内膜,进入基质,的,蛋白质可以先通过TOM复合体进入膜间隙，然后通过TIM复合体进入基质。,也可以通过线粒体内、外膜间的接触点（鼠肝直径1um线粒体上约115个接触点），一步进入基质，在接触点上TOM与TIM协同作用完成蛋白质向基质的输入.,线粒体内外膜的接触点,蛋白质分子进入线粒体基质的模型：,1,、前体蛋白在核糖体合成，进入胞液,2,、分子伴侣蛋白结合前体蛋白,3,、信号序列与,TOM,识别，被转运跨过外膜,4,、前体蛋白在膜间质与,TIM,接触，被转运进入线粒体基质,5,、,基质靶向序列,被,水解，蛋白折叠形成天然构象,线粒体膜间质蛋白转运,：,转运开始与基质蛋白相同，当抵达TIM后：,A. 前体蛋白先进入线粒体基质，基质导入序列被切除，膜间质导入序列使蛋白通过内膜上的复合体被送,回,到膜间质，膜间质导入序列被切除后，蛋白折叠成天然构象。,B. 只有前体蛋白的基质导入序列进入基质被切除，膜间质导入序列进入内膜也被切除，未进入内膜的膜间质蛋白释放在膜间质,。,以上转运,机制是,高度保守的,转运系统缺陷可导致人体疾病,线粒体,外膜和内膜蛋白的转运机制,现在,不清,楚,（二）,细胞核蛋白质的定位,细胞核蛋白在胞液合成后，,通过核孔复合物,输入核内。,靶向输送的,核蛋白多肽链内含有特异的信号序列，称为核定位序列NLS,（nuclear localization signal,）,。,NLS可位于肽链的不同部位,，在,蛋白质进入核定位后,不被切除,。,NLS为48个氨基酸残基的短序列，富含带正电荷的赖、精氨酸或脯氨酸，不同NLS间未发现共有序列。该序列是在SV40中的T抗原上发现的。,许多,蛋白质在其序列上也有共同的信号类型，负责把蛋白质从细胞核转运至细胞质，这些模体称为,核输出信号,(nuclear export signal,，,NES,),，,10,个,aa,左右，含有一组保守的亮氨酸组合模式。,核蛋白靶向输送需要输入因子,、,和一种小,GTP,酶,Ran,蛋白参与。输入因子,杂,二聚体输入蛋白,importin,可,作为胞核蛋白受体，识别结合,NLS,序列。,输送过程：,1,）胞液合成胞核蛋白结合输入因子,二聚体形成复合物，并被导向核膜的核孔。,2）由小GTP,酶Ran水解GTP释能，胞核蛋白输入因子复合物通过耗能机制跨核孔转位，进入核基,质,。,3）转位中，输入,因子,和先后从上述复合物解离，胞核蛋白定位细胞核内。输入因子、 移出核孔再被利用。,Ran-GAP,RanGTP Ran-GDP,Ran核苷酸交换因子,金标记的核质素穿越核孔,蛋白质通过细胞核孔复合体进入细胞核,（三）,过氧化物酶体蛋白的定位,在细胞液中自由核糖体上合成。,折叠好后进行转运,三,信号肽段,1、C-末端有一保守的SKL序列,，例如,过氧化氢酶，脂酰辅酶A氧化酶,。蛋白进入后,不会被切除,。,2,、过氧化物酶体靶向信号,1,（,peroxisome,-targeting signal 1,，,PTS1,）,加到,C-,末端,足以进入过氧化物酶体，蛋白进入后,被切除,。,3,、N-末端的一段序列,，,PTS2,，例如硫解酶，蛋白进入后,被切除,。,Zellweger综合症,（四）,分泌蛋白的定位,真核细胞分泌蛋白,等,前体合成后,靶向,输送,过程首先,要进,粗面内质网,。,Destinations in,eucaryotic,cells,Import,Export,各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽，约1336氨基酸残基分为三段。N端为碱性区，含有一到二个碱性氨基酸残基；中间为疏水核心区，约1015个氨基酸残基，主要为疏水中性氨基酸；C端为加工区，多含极性、小侧链氨基酸，紧接着是被信号肽酶裂解的位点。,信号肽,(signal peptide),信号肽的一级结构,靶向输送蛋白的信号序列或成分,靶向输送蛋白,信号序列或成分,分泌蛋白,N,端,信号肽,内质网腔蛋白,N,端,信号肽，,C,端,-Lys-Asp-Glu-Leu-COO,-,(KDEL,序列,),线粒体蛋白,N,端,信号,序列（,20,35,氨基酸残基）,核蛋白,核定位序列（,-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-,，,SV40 T,抗原）,过氧化,酶,体蛋白,C,端,-Ser-Lys-Leu-,（,SKL,序列）,溶酶体蛋白,Man-6-P,（甘露糖,-6-,磷酸）,KEDLR-GFP,激光共聚焦显微镜下的,ER,分泌蛋白质进入内质网，需要多种蛋白质成分参与。,1,）存在于胞液中的信号肽识别颗粒（,SRP,）由,6,个亚基和,1,个,7S RNA,组成的核蛋白，可结合,GTP,且具有,GTP,酶活性。,2,）存在于内质网膜上的,SRP,受体,可结合,SRP,，又称为,SRP,对接蛋白（,DP,），,DP,有,、,亚基，其中,亚基可结合,GTP,且具有,GTP,酶活性。,3,）存在于内质网膜上的,核糖体受体,可与核糖体大亚基结合，使其锚定在内质网膜上。,4,）肽转位复合物为多亚基的,ER,膜蛋白，可形成新生肽链跨,ER,膜的,蛋白通道,。,分泌蛋白进入内质网的过程：,1,）在胞液游离核糖体上以,mRNA,为模板，合成出,N,端包括信号肽约,70,个氨基酸残基。,2,）,SRP,与,N,端的信号肽、,GTP,和核糖体结合成复合物，肽链合成暂停，,SRP,识别,ER,膜上的,SRP,受体，通过水解,GTP,使,SRP,解离并再利用，使肽链开始继续延长。,3,）核糖体大亚基与核糖受体结合，锚定在膜上，水解,GTP,供能，诱导肽转位复合物开放跨,ER,膜通道，信号肽插入内质网膜。,4,）信号肽启动肽链转位，延长的多肽链直接经核糖体，及跨,ER,膜通道进入内质网腔。信号肽被信号肽酶切除并降解。,5,）内质网腔,HSP70,消耗,ATP,促进延伸多肽链进入,ER,腔并折叠成天然构象。,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,ER,腔中的蛋白质的去向：经高尔基体修饰后形成分泌小泡，被调节性或非调节性地运送到细胞外面去。通过分泌小泡被运送到溶酶体中。通过分泌小泡，送回到内质网腔中。,（五）膜蛋白的插入具有方向性,内质网膜、细胞质膜、高尔基复合体膜,从粗糙内质网上进入后再转运到这些膜上,螺旋跨膜,蛋白,红细胞质膜：血型糖蛋白,肝细胞质膜：低密度脂蛋白受体,高尔基体膜：半乳糖转移酶，唾液酸转移酶,蛋白质插入膜上，具有特定位向,膜蛋白在插入内质网膜的时候其拓扑定位就已确定,所有膜蛋白的,拓扑定位,主要由存在于其肽链上的,拓扑序列,决定的,拓扑序列：,25,个氨基酸残基,包括内质网跨膜信号序列，停止转运序列，膜锚定序列,有些蛋白是通过一共价连接的,糖基磷脂酰肌醇（,GPI,）,而锚定在膜上的。,膜蛋白的定位,三、蛋白质定位出错引起的疾病,在有机体内，所有的生物分子都是协同作用的，均是在,特定的部位、特定的时间,，行使其特定的功能。如果溶酶体中诸多的,水解酶没被特定的信号局限在溶酶体内，而散流在细胞和机体的任意部位，对细胞和机体将是,有害的,。,同样地，在细胞内合成的,蛋白质如果不能正确定位，而是在不适当的部位大量堆积，必然会导致疾病的发生,。目前已经发现，一些疾病与蛋白质的不正确定位有关。,End,Thank you!,
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