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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,9/11/2024,83,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,第二章,蛋白质的修饰与降解,第一节 蛋白质的修饰,蛋白质的翻译后修饰指对蛋白质进行共价加工的过程，可调节蛋白质的活性、定位、折叠、以及蛋白蛋白相互作用,。,磷酸化,脂基化,甲基化,乙酰化,糖基化,SUMO,化,巴豆酰化,一、磷酸化,磷酸化,去磷酸化,催化磷酸化的蛋白激酶,蛋白质丝氨酸,/,苏氨酸激酶,PKA PKC PKG,蛋白质酪氨酸激酶,PTK,非受体型,Src,受体型,EGFR IGFR PDGFR,双专一性蛋白激酶,DSPK,Weel,ERK1 EKR2,cAMP,激活,PKA,影响糖代谢示意图,调节基因表达,调节细胞极性,PKA,亦可通过磷酸化作用激活离子通道，调节细胞膜电位。,2. IP,3,/DAG-PKC,通路,促甲状腺素释放激素、去甲肾上腺素、抗利尿素与受体结合后所激活的,G,蛋白可激活,PLC,。,PLC,水解膜组分,PIP2,，生成,DAG,和,IP3,。,IP3,促进细胞钙库内的,Ca,2+,迅速释放，使细胞质内的,Ca,2+,浓度升高。,Ca,2+,与细胞质内的,PKC,结合并聚集至质膜。质膜上的,DAG,、磷脂酰丝氨酸与,Ca,2+,共同作用于,PKC,的调节结构域，使,PKC,变构而暴露出活性中心。,PKC signaling,激素,EGFR,介导的信号转导过程,催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶,蛋白质丝氨酸,/,苏氨酸磷酸酶,PP1,、,PP2A,、,PP2B,、,PP2C,蛋白质酪氨酸磷酸酶,1/3,是跨膜的，类似受体,2/3,是游离于胞质，为非受体型,二、脂基化,为长脂肪链通过,O,或者,S,原子与蛋白质缀合的过程，通常是蛋白质分子的半胱氨酸残基被棕榈酰化或者法呢基化。,铜蓝蛋白,Leu-Ala-Gly-Cys,分别催化的酶是棕榈酰基转移酶,法呢基转移酶,三、甲基化,S-,腺苷甲硫氨酸提供甲基集团,甲基转移酶,组蛋白,Lys,Arg,四、 乙酰化,乙酰基,乙酰基转移酶 主要,Lys,组蛋白的乙酰化调控基因转录,调控自噬,调节代谢酶的活性,五、类泛素化,-,SUMO,化,(small,ubiquitin,related modifier),小泛素相关修饰物，分子结构类似泛素,E1,活化酶、,E2,结合酶、,E3,连接酶,SUMO,的,C-,端,Gly,残基和底物蛋白,Lys,的,-,氨基间形成一个异肽键,SUMO,的,C-,末端短肽切除，暴露出,Gly-Gly,模特序列，使其变成成熟的功能蛋白,去,SUMO,化,Ulp,蛋白质,SUMO,化,Ulp,Ulp,蛋白质,SUMO,化,SUMO,化修饰的生物学作用,底物多为转录调节因子或共调节因子,参与维持基因组的完整性及调节染色体的凝集与分离,参与,DNA,修复,拮抗泛素作用,调节蛋白的核质转运和信号转导,六、巴豆酰化,巴豆酰基,巴豆酰基转移酶 组蛋白,Lys,基因活化,七、不同翻译后修饰相互协调与影响,细胞信号转导过程中存在多种蛋白翻译后修饰,一种蛋白质可以有一种以上的翻译后修饰,八、研究策略,放射性跟踪,修饰性抗体技术,质谱技术,第二节,蛋白质的降解,细胞内的蛋白质分子处于一动态平衡过程中。进行自我更新。,蛋白质降解途径：,泛素,-,蛋白酶体系统（,ubiquitin-proteasome,system,UPS,）,自噬溶酶体（,autophagy-lysosome,）系统,蛋白质分子降解的生理功能：,1、清理不正常蛋白质的管家功能,2、破坏正常蛋白质的调节功能,细胞内成分的主要降解途径,1,、蛋白酶体途径：,降解细胞内,短寿,(short-lived,),、,多聚泛素化,(,ubiquitination,),的蛋白质。,原核生物：通过,19S,的蛋白酶体能识别靶蛋白的特定氨,基酸序列并将其降解。,真核生物：则是通过,26S,的蛋白酶体降解蛋白质。,2,、内吞途径：,将,跨膜蛋白,运送到溶酶体降解。,3,、细胞自噬途径,：,而,长寿蛋白,(long-lived protein),、,蛋白聚,集物,及膜包被的,细胞器,是通过细胞自噬的方式在溶酶体降解。,一、,UPS,（,ubiquitin-proteasome,system,）,组成,20S,核心颗粒,蛋白酶体激活因子,19S,、,11S,、,PA200,分类,ATP,和泛素依赖的,UPS-19S,不依赖,ATP,和泛素的,UPS-11S,降解变性和错误折叠的蛋白质,泛素,76个氨基酸的小分子蛋白(8.5kD),普遍存在于真核生物而得名,一级结构高度保守,蛋白质的泛素化主要发生在赖氨酸残基的,侧链，且通常是多泛素化。结合泛素的蛋白质,能被蛋白酶体识别进而被降解，泛素相当于蛋,白质被降解的标签。,1. 泛素化(ubiquitination),泛素与选择性被降解蛋白质形成共价连接，并使其激活。(赖氨酸),2. 蛋白酶体(proteasome)对泛素化蛋白质的降解,泛素介导的蛋白质降解过程,泛素化过程,E,1,：泛素活化酶,E,2,：泛素携带蛋白,E,3,：N-,去稳定残基,识别蛋白,泛素,C,O,-,O,+,HS-E,1,ATP,AMP+PPi,泛素,C,O,S E,1,HS-E,2,HS-E,1,泛素,C,O,S E,2,泛素,C,O,S E,1,被降解蛋白质,HS-E,2,泛素,C,O,S E,2,泛素,C,NH 被降解蛋白质,O,E,3,带有成串泛素分子的底物蛋白再被26S蛋白酶复合体识别,蛋白酶复合体分子量极其巨大,在蛋白酶复合体腔中，蛋白质被水解,The,oncoprotein,SS18-SSX1 promotes p53,ubiquitination,and degradation by enhancing HDM2 stability.,Transfection,Example,Mol Cancer Res,. 2008 Jan;6(1):127-38.,稳定残基:半胱、丙、丝、苏、甘、缬、蛋,肽链内部的保守序列：PEST,使蛋白质分子短命,-,UPS,识别信号,去泛素化酶（,deubiquitinating,enzyme,，,DUB,）,如,周期蛋白，,基因表达、细胞增殖、炎症反应、诱发癌瘤,（促进抑癌蛋白P53降解）,蛋白浓度的周期性降低正是泛素介导的蛋白酶复合体作用的结果。,体内蛋白质降解参与多种生理、病理调节作用,二、自噬溶酶体系统,什么是自噬？,自噬（,autophagy,）是真核生物进化过程中高度保守一类降解途径，通过形成双层膜的自噬体，将蛋白质等生物大分子或细胞器（线粒体等）回收至溶酶体将其降解为氨基酸、单糖等小分子，实现循环再利用。,自噬体的半衰期,8 min,左右，是细胞对于环境变化的有效反应。,自噬性细胞死亡,是,凋亡和坏死,之外的第三种程序性细胞死亡方式,.,细胞自噬的分类,1,、巨型细胞自噬,(,macroautophagy,),，,又称为,大自噬,，是指细胞内,新生的球状脂质双层,包裹胞浆蛋白和细胞器，并运送到溶酶体降解的自噬行为。,2,、微型细胞自噬,(,microautophagy,),，又称为,小自噬,，是指通过,溶酶体膜,的内陷、突起和,/,或分隔，直接吞入细胞浆的自噬行为。,3,、分子伴侣介导的细胞自噬,(chaperone mediated,autophagy,，,CMA),，,是指由,分子伴侣,将靶蛋白转送至溶酶体内的自噬行为。这只见于哺乳类动物细胞。,根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同,Autophagy,Autophagy,is a cellular,degradation system,in which,cytoplasmic,components, including organelles, long-life protein are sequestered by double-membrane structures called,autophagosomes,and the sequestered materials are degraded by,lysosomal,hydrolases,Control,Starvation,基础自噬：,是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬过程,对细胞内物质的更新及细胞内环境稳态的维持具有不可或缺的作用。,诱导自噬：,是细胞应对外界刺激的一种保护反应。缺少营养物质或能量、受到氧胁迫等情况下,细胞的自噬水平在短时间内剧烈升高的细胞自噬过程。,如哺乳动物出生后初期,由于母体不再提供营养来源,幼体的细胞自噬非常活跃,这为维持其生命活动起了非常重要的作用。,基础自噬和诱导自噬,自噬进程,1,、自噬的诱导激活,2,、自噬体的成核和延伸,3,、自噬体与溶酶体融合,4,、内容物降解,第一步：,自噬的诱导,一系列自噬相关基因（,autophagy,-related gene,，,Atg,）组成的复合体参与调控自噬体的形成。主要是,Atg1/ULK1,复合体,，包括,Atg1,、,Atg13,、,Atg17, mTORC1,磷酸化,Atg1/ULK1,和,Atg13,抑制自噬的起始。,mTORC1,失活,自噬激活,ULK1,去磷酸化,Atg7 -Atg3-,induction,第二步：,自噬体的成核，,细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆中形成一个小的膜样结构,:,分离膜,(isolation membrane,，,IM),，,然后不断向两边延伸，成扁平状，被称为前自噬体,(pre-,autophagosome,PAS),，是自噬发生的标志之一。需要,Atg6,（,Beclin1,）,-Class PI3K,复合体,以及,Atg12-Atg5-Atg16L,复合体,.,形态特点：,自噬前体多呈新月形或半环形，为游离双层膜结构，两层膜之间有腔。随着自噬前体增大和包裹内容物，内腔变得不明显。多种,ATG,蛋白参与自噬前体的组装。,组分来源：,来源于独立形成的特殊膜结构或线粒体、内质网或高尔基复合体等膜结构。,Atg7 -Atg3-,induction,第二步：,自噬体膜的延伸，,自噬前体在两个类泛素系统作用下，包括,Atg12-Atg5-Atg16L,复合体,和,LC3(Atg8),作用下，,LC3,不断接受,PE,，扩展膜的长度，成为成熟的闭合自噬泡,。,形态特点：,自噬前体由半月形，不断延伸成闭合的完整的双层膜结构的圆形自噬泡，内容物为不断捕获的待降解的衰老的蛋白、细胞器、蛋白聚集体。,Atg7 -Atg3-,第三步：,自噬体与溶酶体的融合,，,被运送到溶酶体，两者的生物膜融合，变成一个自噬溶酶体,(,atuolysosome,),。,形态特点：,多呈圆形或椭圆形。由于自噬体内膜很快被降解，在透射电镜下自噬溶酶体常不易与其他形式的溶酶体区别。,第四步：,自噬溶酶体内的酸性水解酶降解囊泡中的内容物，成为降解性自噬体,(,degradative,autophagic,vacuole),。,自噬的诱导,自噬体的成核,和延伸,自噬溶酶体的形成,内容物的降解,自噬的调节,1,、,mTOR,活性调节,2,、胰岛素（激活,mtor,；抑制,FoxO3,）,自噬调控的中心分子,TOR(target,of,rapamycin,),雷帕霉素作用的靶位点,( T,aget,of,rapamycin, TOR ),是氨基酸、,A T P,和激素的感受器,它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。,TOR(target,of,rapamycin,),能感受细胞的多种变化信号,加强或降低自噬的发生水平。细胞内,ATP,水平、缺氧等细胞信号都可直接或间接通过,TOR,将其整合,从而改变细胞的自噬发生,应对不同的外界环境刺激。,Atg1,是一种丝氨酸,/,苏氨酸蛋白激酶,哺乳动物中同源蛋白,ULK1, ULK1,以复合物的形式存在,除了,ULK1,本身,还包括,mAtg13,、,FIP200(,一种与黏着斑激酶,FAK,相互作用的蛋白,),和,Atg101,。,Atg1/ULK1,蛋白激酶复合体,当营养足够时,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物,1( mTORC1),与,Atg1/ULK1,复合物与结合,通过磷酸化,Atg1/ULK1,和,ATG13,从而抑制自噬的起始从而抑制自噬。,在饥饿的条件下, mTORC1,从,Atg1/ULK1,复合物上分离,从而,诱导自噬体的成核,(Nucleation),和延伸,(Elongation),。,AMPK,是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。低,ATP,水平状态下,(,如饥饿或缺氧,)AMPK,能感受,AMP,的水平变化而激活,从而磷酸化结节性硬化复合体,TSC2(tuberous sclerosis protein),加强,TSC1/2,对,Rheb,的抑制,最终使,mTOR,的活性被抑制,诱导细胞发生自噬。,AMPK(AMP-activated protein,kinase,),Atg9,是迄今发现的唯一一个编码跨膜蛋白的,Atg,基因,能通过影响膜泡运输对自噬发生起调控作用。,营养物质缺乏,时, Atg9,与,Atg23,、,Atg27,结合,将它们运,输至,PAS;,Atg9/mAtg9,在,Atg5-Atg12-Atg16,连接系统中,首先由,Atg7(E1),活化,Atg12;,然后将,Atg12,传递给类,Atg10,（,E2,）最后, Atg12,被传递到,Atg5,与,Atg5,的,Lys,共价结合形成,Atg12-Atg5,复合物。自噬发生时, Atg16,和,Atg12-Atg5,结合，,Atg16,含有一个螺旋卷曲结构易于形成低聚物,使得其能把更多的,Atg12-Atg5,连接起来形成巨大复合物。从而可能为参与自噬泡形成的蛋白质提供相互作用的平台。,自噬发生时,此复合物定位于隔离膜上,参与,LC3-II,的形成过程,从而促进自噬泡膜的延长。,自噬发生过程中有两组,类泛素化修饰,过程,分别发生在,Atg5-Atg12-Atg16,连接系统和,Atg8/LC3,连接系统中,用于,隔离膜的延长和自噬泡的形成,。,Atg5-Atg12-Atg16,复合物,Atg8/LC3,LC3,：,是酵母,Atg8,分子在哺乳动物中的同源物，是自噬发生的一个标志蛋白。,功能：促进,自噬泡膜的延长和融合,是自噬泡形成所必需的。,LC3,合成后,最初以,pro-LC3,形式存在,然后立刻被,Atg4B,切割形成,LC3-I,。自噬发生时,均匀分布于细胞质中的,LC3-I,被,Atg7,（,E1,）,活化并与其形成硫酯键,然后被传递给,Atg3,（,E2,）,并最终在,Atg5-Atg12-Atg16,复合物,（,E3,）,的帮助下连接上一个,PE,分子,形成具有膜结合能力的,LC3-II,。,Atg16L,的细胞定位决定了,LC3,成熟的位置,并促进,LC3-II,结合到自噬泡上。,自噬小泡的成核,需要含有,ATG6(,其哺乳动物同源蛋白命名为,Beclin,1),的复合物,这个复合物能够与第三类磷酸肌醇,3,激酶,VPS34,形成超级复合物并使其激活产生磷脂酰肌醇,3,磷酸。,PI3P,可以组装一些含有,PX,和,FYVE,结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置,促使自噬前体的形成,。,ATG6/Beclin-1,Vps34,是哺乳动物中的第,III,类,PI3 K,。在,Vps34,复合物中, Vps34,因结合,Vps15,而被激活,并进一步结合,Beclin1,形成,Vps34-Vps15-Beclin1,复合体,。,功能：,自噬发生时, Vps34-Vps15-Beclin,和,多种自噬相关蛋白结合,传递自噬信号促进自,噬发生。,Vps34/PI3K-Beclin1,复合物,1,、,如与,Atg14,结合形成,Atg14-Vps34-Vps15-Beclin1,复合物参与自噬泡的形成,;,2,、与,VRAG,结合形成,VRAG-Vps34-Vps15-Beclin1,在自噬泡成熟和运输中起作用。,3,、,促进产生磷脂酰肌醇,-3-,磷酸,(PI3P), PI3P,可以组装一些含有,PX,和,FYVE,结构域的蛋白质到早期自噬泡产生的位置,促使自噬前体的形成。,自噬的分子机制,mTORC1,：哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白复合物,1,Atg12/LC3,：两种泛素样加工系统，包裹自噬底物形成自噬体。,Atg12-Atg5-Atg16L1:,与外膜结合，促进伸展,Atg5:,决定膜伸展方向,LC3-,：自噬体标志分子，判断诱导或抑制,Atg9:,嵌膜蛋白来回循环移动活化该激酶复合物从而产生自噬分隔膜。,PE:,磷脂酰乙醇胺,Physiological and pathological,roles of,autophagy,1,、应激功能,细胞自噬是细胞在饥饿条件下的一种存活机制。,在营养充足条件下，自噬发生处于较低水平，仅在胞质中去除受损和多余的细胞器以维持细胞内环境稳定，称为基本自噬。细胞营养缺失时，细胞立即启动自噬以维持胞质中氨基酸池的平衡，可通过合成新的蛋白质、能量生成和促进糖异生来避免细胞,“,饿死,”,。,自噬的生物学意义,2,、防御功能,在细胞受到致病微生物感染时，细胞自噬起一定的防御作用。,某些细菌和病毒可逃离异噬途径，避免溶酶体,消化。李斯特菌属、志贺杆菌属、立克次体属等的,细菌可通过降解异噬体膜逃入细胞质。细胞能够通过自噬发挥先天性免疫作用，抵抗细菌入侵。结核杆菌通常定居于异噬体内，但可激活自噬途径被溶酶体酶杀死。,自噬也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫，还可以将病毒抗原递呈给 类分子激活适应性免疫，发挥抗病毒作用。,4,、延长寿命,细胞自噬可降解损伤的细胞器、细胞膜和变性蛋白等胞内成分。,如果细胞自噬受损衰竭，细胞损伤就会堆积、累加，产生老化。,长期减少热量摄入，在一些物种能延长寿命。,3,、维持细胞稳态,在骨骼机和心肌，细胞自噬有特殊的,“,看家,”,(house keeping),功能，帮助细胞浆成分，包括线粒体，进行更新。,自噬样细胞死亡（,autophagic,cell death,，,ACD,）：,在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（,pyknosis,）,核破裂、细胞皱缩、没有凋亡小体的形成等，被称为,自噬样细胞死亡，,它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为,Type II cell death,，,相应的,，,凋亡为,Type I cell death,，,坏死为,Type III cell death,。,尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是自噬引起死亡还是死亡时有自噬发生，但不是直接原因？,5,、参与控制细胞死亡及癌症,自噬在肿瘤发生中的双重作用，在多种人类肿瘤中均存在自噬活性的改变。,一方面，自噬可抑制肿瘤的发生,:,首先，自噬可清除受损细胞器以避免有害的氧自由基蓄积及突变的发生。,其次，自噬可限制,DNA,损伤，维持基因组完整性。在永生化鼠肾上皮细胞中自噬活性降低可导致细胞,DNA,损伤，基因扩增，染色体非整倍性，从而增加了致癌性突变率，促进了肿瘤的发生。,再次，自噬可抑制细胞生长，诱发凋亡性细胞死亡。,细胞自噬与肿瘤,另一方面，,自噬通过限制细胞坏死和炎症促使肿瘤细胞存活于代谢性应激的环境中，这些肿瘤细胞所具有的高自噬活性能增强肿瘤对应激的适应性，,对肿瘤细胞在恶劣环境中的生存起到了一定的保护作用,。当快速生长的肿瘤细胞缺乏营养时，实体肿瘤内部血供不良，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养及能量，可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。,自噬检测技术,1,自噬性结构的电镜下形态学观察,-,电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构,电镜下可观察到双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体结构,其中包裹着未被完全降解的胞浆成分。,初始自噬囊泡,(,Avi,),降解自噬囊泡,(,AVd,),缺点：电镜观察仅能,证明自噬性结构的存在,，难以反映自噬活性的强弱。,2,基于自噬体标记蛋白,LC3,的检测方法,微管相关蛋白,1,轻链,3(LC3), LC3-,始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体,的标记，,2.1,通过构建绿色荧光蛋白,(GFP),和,LC3,的融合蛋白,通过荧光显微镜就可观察,LC3,在细胞中的定位。,通过免疫荧光的方法检测内源性,LC3,或转染,GFP-LC3,融合蛋白的表达，自噬诱导后的细胞表现为点状聚集增理论上，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量，根据点状聚集的密集程度可以判断细胞自噬的情况。,可以从总体上大致反映自噬的增加或减少,除了荧光显微镜观察,LC3,外,LC3,还是生化方法检测自噬体的有利工具。内源性,LC3-II,的量在某种程度上可反映细胞自噬活性。因此,通过免疫印记方法检测,LC3-II,信号的强弱来对哺乳动物细胞自噬活性进行定量检测。,2.2,LC3-,的水平在某种程度上反映了自噬体的多少,Control,Starvation,X depletion,promotes,autophagy,Si-X,control,Starvation,LC3,p62,-,actin,Starvation,+,+,-,-,X Know down,Mock,X,Nutrient,LC3,GFP-LC3,切割,LC3,连同自噬体内膜和内容物一起被溶酶体降解，但,GFP,在溶酶体中仅表现荧光信号猝灭，,GFP,本身并不被降解，在自噬性溶酶体降解后会释放出游离的,GFP,有鉴于此，通过免疫印迹的方法,检测游离,GFP,蛋白的出现即意味着自噬性降解的发生,。,GFP,2.3 GFP-LC3,剪切分析,3,基于自噬性降解的检测, “,自噬潮”分析,自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。,3.1,长寿命蛋白降解,根据自噬机制主要负责降解长寿命蛋白的特性，先让细胞在含有同位素标记氨基酸的培养基中生长一段时间,(,数小时至数天,),，细胞在此期间合成的蛋白质都将被同位素标记，然后换成不含同位素的培养基，让一些被标记的短寿命蛋白通过蛋白酶体途径降解,在自噬诱导后，通过检测培养上清中释放的自噬性降解产物的放射性活度即可反映细胞自噬性降解的能力。,优点：,较单纯自噬体检测更能反映自噬活性， “自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指标,。,自噬诱导后，融合表达,GFP-LC3,蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体融合，溶酶体内的酸性环境可以导致,GFP,荧光信号的猝灭，红色荧光蛋白,RFP,对酸性环境具有很好的耐受性借助于两种荧光蛋白的这种差异，通过构建,RFP-GFP-LC3,串联体,，在自噬诱导后，可以观察到自噬体和自噬溶酶体分别成黄色和红色标记，如果自噬潮增加，两种颜色的点状聚集均增。如果自噬体向自噬溶酶体成熟步骤受阻，黄色点状聚集增加，红色不增加,优点：实现了自噬体向溶酶体转化步骤的监控。,不足：不能反映降解过程。,3.2 RFP-GFP-LC3,的溶酶体呈递,通过,RNAi,干扰,Atg3 Atg5 Atg7,及,Beclin1,等自噬相关基因的表达后，细胞表现为自噬功能缺失，与工具药相比，通过基因沉默或敲除技术来抑制自噬具有相对强的特异性。,4,RNAi,干扰,体内自噬分析的策略有三种：,一、传统的基于对组织切片标本进行电镜观察和,LC3,蛋白的检测。,二、应用,GFP-LC3,转基因小鼠实现体内自噬的实时监测。,三、通过构建自噬相关基因缺失的实验动物，这为研究自噬在机体水平所发挥的作用并验证体外试验的结果提供了很好的平台 ，实现体内自噬活性的实时监控，而仅凭观察到的自噬体出现无法说明自噬活性的改变。,5,体内自噬分析,Vps34f/f,MEFs,2011 Nadia,Jaber,PNAS,2008,Gbor Juhsz,JCB,The class III PI(3)K Vps34 is essential for,autophagy,自噬的抑制,根据自噬形成的过程，自噬的抑制分为不同的阶段：,（,1,）对自噬体形成的抑制：主要是,PI3K,通路的抑制剂，,3-MA,Wortmannin,，,LY294002,等,（,2,）对自噬体与溶酶体融合的抑制：有巴伐洛霉素,A1,、长春碱、诺考达唑等。,（,3,）对溶酶体降解的抑制,:,氯喹、蛋白酶抑制剂，如,E64d,、,Pepstatin,A,等,JCB,DFCP1,自噬体系和蛋白酶体系,自噬与,UPS,之间在功能上有重叠,-,错误折叠蛋白,HSP70,介导的自噬，,HSP70,底物可被泛素化,错误折叠蛋白的聚集体被巨自噬降解,神经元蛋白,-,突触核蛋白,自噬与,UPS,相互影响,End,Thank you!,
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