《基因工程概论》课件Chapt2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程概论,基因工程概论,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第二章 基因操作的工具酶,基因工程的工具酶,(instrumental enzyme of gene engineering):,是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取和重组体,DNA,制备等程序中所需要的酶类。,能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为,核酸酶,。,核酸酶的,分类,：,第二章 基因操作的工具酶,1,、根据核酸底物分：,（,1,）,RNA,酶（,RNase,）：作用底物是,RNA,；,（,2,）,DNA,酶（,DNase,）：作用底物是,DNA,；,（,3,）底物非专一性核酸酶：底物可以是,DNA,也可以是,RNA,。,第二章 基因操作的工具酶,2,、根据对底物作用方式分：,（,1,）核酸内切酶（,endonuclease,）：从核酸内部切割磷酸二酯键；,（,2,）核酸外切酶（,exonuclease,）：从核酸分子末端开始一个一个切割核苷酸；,（,3,）少数核酸酶：既能够内切又能够外切。,第二章 基因操作的工具酶,3,、根据对底物碱基专一性分：,（,1,）碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）；,（,2,）碱基非专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随意）。,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled,enzymology,. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,50,年代初发现了由寄主控制的,限制和修饰现象,(B),(K),大肠杆菌,B,大肠杆菌,K,1,1,4,10,4,10,4,E.O.P,成斑率,efficiency of plating,限制,修饰的酶学假说,(B),(B),酶切位点,不被修饰,噬菌体,DNA,被切割,酶切位点,被修饰,Methylation,基因组,DNA,不被切割,1968,年，,Meselson,和,Yuan,从大肠杆菌,K,和,B,中发现了,I,型限制性核酸内切酶；,1970,年，,Smith,和,Wilcox,从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个,II,型限制性核,酸内切酶,Hin,d II,，使得,DNA,分子的体外精确切割成为可能。,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的概念,限制性核酸内切酶（,Restriction,endonucleases,）：,是一类能够识别双链,DNA,分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链,DNA,分子的核酸内切酶。,已经从近,300,种微生物,中分离出了,500,余种限制性核酸内切酶。,限制性核酸内切酶的分类,1.,限制修饰活性,2.,内切酶的蛋白,质结构,3.,限制辅助因子,4.,切割位点,5.,特异性切割,6.,基因克隆中,I,型,单一多功能的酶,3,种不同亚基,ATP,、,Mg,2+,和,S-,腺苷甲硫氨酸,距特异性位点,1000bp,不是,无用,II,型,限制酶和修饰酶分开,单一成分,Mg,2+,特异性位点及其附近,是,非常有用,III,型,双功能酶,2,种亚基,ATP,、,Mg,2+,和,S-,腺苷甲硫氨酸,特异性位点,3,端,24-26bp,处,是,有用,限制性核酸内切酶的命名,1,、,寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成,3,个斜体,字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌,Escherichia,coli,表示为,Eco,流感嗜血菌,Haemophilus,influenzae,表示为,Hin,；,2,、,用一个正体字母表示菌株的类型，比如,Eco,R,、,Hin,d,；,3,、,如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则,用罗马数字标出，比如,Eco,R,I,、,Hin,d,III,。,*,星号活性,(star activity):,也称星活性，同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，例如酶浓度过高、反应液离子强度过低、,pH,改变、反应液中,Mg,2+,被,Mn,2+,代替、有机溶剂影响时等，酶切割位点专一性发生改变。这个特性称为星号活性。在这些酶制剂的包装和产品说明书上注明（,*,），以表示区别，提示使用者注意。,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,II,型限制性核酸内切酶的,3,大特点,1,、识别位点的特异性,每种酶都有其特定的,DNA,识别,位点，通常是由,4,、,5,、,6,或,7,个核苷酸组成的特定序,列（靶序列）。,2,、识别序列的对称性,靶序列通常具有双重旋转对称,的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。,3,、切割位点的规范性,双链,DNA,被酶切后，分布在两,条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平,末端的,DNA,分子）。,Sma,I CCCGGG,GGGCCC,EcoR,I GAATTC,CTTAAG,EcoR,I,5-G,AATT,C-3,3-C,TTAA,G-5,Sma,I,5-CCC GGG-3,3-GGG CCC-5,粘性末端,平末端,与,II,型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端,cohesive,ends,因酶切位点在两条,DNA,单链上不同（对称）酶切后形,成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很,容易,通过互补碱基的配对而重新,连接,起来。,平 末 端,Blunt end,因酶切位点在两条,DNA,单链上相同，酶切后形成的平齐,的末端结构，这种末端,不易,重新,连接,起来。,同裂酶,isoschizomers,能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。,同尾酶,isocaudamers,识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一,类限制性核酸内切酶。,注 意：,由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶,消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的,任一种所识别。,几种,II,型限制性核酸内切酶的酶切位点,Pst,I,Provindencia,stuartii,164,CTGCAG,GACGTC,Haemophilus,influenzae,Rd,经同尾酶消化的,DNA,末端连接示意图,5 XXXX,GGATCC,XXXXXX 3,3 XXXX,CCTAGG,XXXXXX 5,Bam,H,I,5 XXXX,G GATCC,XXXXXX 3,3 XXXX,CCTAG G,XXXXXX 5,5 XXXX,AGATCT,XXXXXX 3,3 XXXX,TCTAGA,XXXXXX 5,Bgl,II,5 XXXX,A,GATCT,XXXXXX 3,3 XXXX,TCTAG,A,XXXXXX 5,5 XXXX,A,GATCC,XXXXXX 3,3 XXXX,TCTAG,G,XXXXXX 5,5 XXXX,A,GATCC,XXXXXX 3,3 XXXX,TCTAG,G,XXXXXX 5,Bam,H,I,Bgl,II,推测酶切割位点出现的频率对于推断,DNA,酶切片段大小很有用。,假定,4,种核苷酸在,DNA,分子上出现的频率相同，那么靶序列为,6,个核苷酸的内切酶在每,4,6,（,=4096,）,个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条,49000bp,长的,DNA,中有,12,个,6,核苷酸识别序列的酶切位点（,49000/4096,）。但事实上并非真正如此，因为,DNA,分子中,4,种碱基的出现频率并不均等。,识别位点在,DNA,分子上出现的频率,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶,一个酶单位,（,U,）,指：,在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为,37,）下，,20,L,反应体系中,1h,完全降解,1 g DNA,所需要的酶量。,影响酶活性的因素很多，最重要的有：,A,。,DNA,的纯度和甲基化程度,B,。,甘油的含量（不超过,5%,）,C,。,反应体系中的离子强度,D,。,反应体系的,pH,值,E,。,反应的温度条件,（通常为,37,）,酶单位的定义和影响酶活性的因素,Buffer (10,X,) 2.0,L,Water 16.5,L,DNA 1.0,L,Enzyme 0.5,L,Volume 20.0,L,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer (10,X,) 2.0,L,Water 16.5,L,DNA 1.0,L,Enzyme 0.5,L,Volume 20.0,L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled,enzymology,. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、,DNA,连接酶作用的特点,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,DNA,连接酶的发现,环形,DNA,分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种,Nick,的酶存在。,1967,年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在,2,条,DNA,链之间形成,磷酸二酯键,的酶,DNA,连接酶（,ligase,）,。,DNA,连接酶,由大肠杆菌基因组,DNA,编码，以,NAD,+,作为能源辅助因子,；,T4DNA,连接酶,由大肠杆菌,T4,噬菌体,DNA,编码，以,ATP,作为能源辅助因子。,（,1970,年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端,DNA,分子，所,以在基因克隆中应用广泛。,Nick,Nick,DNA,连接酶的性质,大肠杆菌的,DNA,连接酶是一条分子质量为,75kD,的多肽链。它对胰蛋白酶敏感，可被其水解。,DNA,连接酶在大肠杆菌细胞中有,300,个分子，主要功能就是在,DNA,聚合酶,催化聚合，添满双链,DNA,上的单链间隙后封闭,DNA,双链上的缺口。这在,DNA,复制、修复和重组中起着重要的作用。,T4 DNA,连接酶分子是一条分子质量约为,60kD,的多肽链，其活性很容易被,0.2mol/L,的,KCl,和精胺所抑制。,T4 DNA,连接酶可连接,DNA-DNA,、,DNA-RNA,、,RNA-RNA,和双链,DNA,黏性末端。,DNA,连接酶作用的特点,A.,连接的两条链必须分别具有,3,端自由羟基（,-OH,）,和,5 ,端磷酸基团（,-P,），而且只有这两个基团彼,此相邻时才能进行连接反应；,B.,在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过,程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有,两种能量分子，即,ATP,和,NAD+,。,OK,NO,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二聚体等,1,、,DNA,连接酶作用的机理,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,DNA,连接反应的条件,连接反应最佳温度为,37,，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，,EcoRI,粘性末端连接部位只有,4,个碱基对，很容易断开。所以,通常在,4-15,连接。,影响连接效率的因素有：,A.,温度（最主要的因素）,B. ATP,的浓度,( 10,M - 1M,),C.,连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）,D.,反应时间（通常连接过夜）,E.,插入片段和载体片段,的摩尔比,转化,4,过夜,加反应液,CK-,重组菌落,CK+,DNA,连接反应,阳性对照：,阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落。确定连接产物已经转化到感受态细胞中。将感受态细胞进行铺板。,阴性对照：,阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落。仅将感受态细胞进行铺,板，涂布的是没有转质粒的,空菌。,这么做的目的是：,如果最后,阴性对照的盘子都有菌落生,长了，那这批结果必然不可,信；如果阳性对照长而目的,盘子没长，那就说明是转化,手法出了问题；如果阳性对,照都没长，那就说明这批感,受态细胞有问题。,转化,4,过夜,加反应液,CK-,重组菌落,CK+,1,、,DNA,连接酶作用的机理,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,粘性末端,DNA,片段的连接,Nick,Nick,平末端,DNA,片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,末端核苷酸转移酶,+,dATP,+,dTTP,3,3,5,5,3,3,5,5,AAAAA,TTTT,DNA,聚合酶,和,T4DNA,连接酶,平末端,DNA,片段加接头连接法,衔接物,(linker),，也叫接头,，,是由人工化学合成的一段,10-12,个核苷酸的,DNA,双链，其中包含有,1,个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的,5,端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用,T4DNA,连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的,DNA,片段。,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4,连接酶,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,Eco,R,I,CCGAATTCGG,GGCTTAAGCC,AATTCGG,GCC,CCG,GGCTTAA,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled,enzymology,. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的性质,纯化的,DNA,pol,I,由一条多肽链组成，约含,1000,个氨基酸残基，分子质量为,109kD,。每个大肠杆菌细胞中含有,400,个分子，在,37,条件下每分钟能催化,667,个核苷酸掺入正在生长的,DNA,链。,DNA,pol,I,在空间结构上近似球体，直径约,65,（,1=10,-10,m,）。在酶的纵轴上有一个约,20,的深沟（,cleft,），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置。,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,E.Coli,DNA,pol,I,）是,Kornberg A. 1956,年首先从大肠杆菌,E.Coli,细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括,3,种不同的酶活力：,5- 3,聚合酶活性,以双链,DNA,为模板，催化单核苷酸结合到引物的,3,末端，并不断延伸。,5- 3,外切酶活性,将双链,DNA,中游离的,5,末端逐个切去。,3 - 5,外切酶活性,将游离的双链或单链,DNA,的,3,端降解。不过对于双链的降解可被,5-3,的多聚活性所抑制。,5,CCG,3,GGCTATCGGA,CCG,GGCTATCGGA,Pol,I + Mg,2+,A,T,A,G,CCT,5,CCGATAGCCT,3,GGCTATCGGA,5,CCGATAGCCT,3,GGCTA,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,Pol,I + Mg,2+,CCGATAGCCT,GGCTA,Pol,I + Mg,2+,T,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的三种用途,A.,制备高比活度的,DNA,探针,利用其,5-3,的外切酶活性及其聚合酶活性。,B.,用于,DNA,连接后的大缺口填充,利用,5-3,的聚合酶活性。,C.,用于,DNA,的序列分析,利用,5-3,的聚合酶活性。,大肠杆菌聚合酶,I,的应用示例,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,CCGATAGCCT,GGCTATCGGA,Pol,I + Mg,2+,缺口转移,(Nick translation),CCG,GGCTATCGGA,CCG,GGCTATCGGA,Pol,I + Mg,2+,A,T,A,G,CCT,缺口转移,(Nick translation),1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,Klenow,片段的主要用途,Klenow,片段,大肠杆菌聚合酶,I,全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段（,76kD,）酶分子，它仍然有,53,的聚合酶活性和,3, 5 ,的核酸外切酶活性，但失去了,53,的外切酶活性。,Klenow,片段的主要用途,修补限制性酶消化,DNA,形成的,3,隐蔽末端,标记,DNA,片段的末端,cDNA,克隆中第二链,cDNA,的合成,DNA,序列的测定,G,AA,CTTAA,1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,T,4,DNA,聚合酶的特点,T,4,DNA,聚合酶是,从,T4,噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和,Klenow,片段相似，也是一条多肽链，分子质量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有,15,个半胱氨酸残基，也一样具有,53,的聚合酶活性和,3 5,的核酸外切酶活性。,其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶,I,的活性高,200,倍。,特别是，,T4DNA,聚合酶还有第三种活力,取代反应：,如果反应体系中仅存在一种,dNTP,，这时,T4DNA,聚合酶就会表现出,3 5,外切酶活力，从双链,DNA,的,3,开始降解，直到露出和该,dNTP,互补的碱基为止，然后就在此位置发生合成和取代反应。,CGTCGC,GCAGCG,CG,T,GCAGCG,T4DNA,聚合酶,Mg,+,CG,GCAGCG,dTTP,Mg,+,T4DNA,聚合酶的用途,1,、以填充反应标记有,5,端延伸的双链,DNA,片段,2,、以取代反应标记延伸末端或平头末端,的双链,DNA,片段,3,、用于,DNA,序列分析,1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,逆转录酶,Reverse transcriptase,逆转录酶是,一种可以有效地将,mRNA,转录成为,DNA,的酶，其产物称为,cDNA(complementary,DNA).,实际上，它也是一种,RNA,依赖的,DNA,聚合酶。,逆转录酶首先是,1970,年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。,这两个课题组的论文都发在了同一期的,Nature,杂志上。,主要用途是,将,mRNA,转录成,cDNA,以制备基因片段。,3 AAAAAAAA,AAAAAAAA,5 TTTTTTTTT,AAAAAAAA,TTTTTTTTT,5 TTTTTTTTT,3 AAAAAAAA,真核生物的,DNA,聚合酶,真核生物中,DNA,的复制依靠,DNA,聚合酶，它有不同的形式（,、,、,、,），此外还有多种蛋白质分子的参与。真核生物中,DNA,聚合酶都没有,53,或,3 5,外切酶活性，聚合机制同原核生物的聚合一样。,DNA,聚合酶中主要的酶（占总量的,80%-90%,）是,DNA,聚合酶,，分子质量,300kD,，含有,4,或,5,个亚基，主要负责染色体,DNA,的复制。,DNA,聚合酶,分子质量,45kD,，仅含有一条链，主要作用是修复核内,DNA,。聚合酶,分子质量,140kD,，存在于线粒体内，负责催化线粒体,DNA,的复制。,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled,enzymology,. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer.,1,、末端脱氧核苷酸转移酶（,terminal,transferase,）,2,、,SI,核酸酶（,SI nuclease,）,4,、碱性磷酸化酶,第四节 修饰性工具酶,末端转移酶的特性,末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转移酶,是一类不依赖于,DNA,模板的,DNA,聚合酶。,该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到,DNA,的在,3,羟基，特别是对于平末端的双链,DNA,末端加尾十分有效。,最常见的用途是在酶切产生的平末端,(,载体和目的基因,),加尾以便于创造粘性的互补末端。,Characters of the polymerase,Terminal,transferase,is the common name of,template-,independant,DNA polymerase. This enzyme is isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3 hydroxyl groups of DNA without the need for a template. The,best primer is,double stranded DNA (,dsDNA,) with blunt ends.,Purine,bases require magnesium ions and,pyrimidine,bases require cobalt ions. The enzyme builds up,homopolymer,chains,if supplied with appropriate,dNTPs,.,The most common use,for this enzyme is the,generation of complementary tails,on DNA fragments and vectors cut with restriction enzymes which generate blunt ends.,平末端,DNA,片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,末端核苷酸转移酶,+,dATP,+,dTTP,3,3,5,5,3,3,5,5,AAAAA,TTTT,DNA,聚合酶和,T4DNA,连接酶,1,、末端转移酶（,terminal,transferase,）,2,、,SI,核酸酶（,SI nuclease,）,3,、碱性磷酸化酶（,Alkaline,phosphatase,）,第四节 修饰性工具酶,SI,核酸酶的特性,这是一种从米曲霉（,Aspergillus,oryzae,）中分离的可以降解单链,DNA,或,RNA,的外切酶,。,其主要用途有：,A,、在,cDNA,合成过程中，切开,cDNA,的发夹末端；,B,、载体构建过程中，切去,DNA,片段的单链尾巴，,形成平末端结构。,3 AAAAAAAA,AAAAAAAA,5 TTTTTTTTT,AAAAAAAA,TTTTTTTTT,5 TTTTTTTTT,3 AAAAAAAA,发夹结构的切除,TTAA,AATT,单链尾巴的切除,1,、末端转移酶（,terminal,transferase,）,2,、核酸酶,SI,（,SI nuclease,）,3,、碱性磷酸化酶,第四节 修饰性工具酶,碱性磷酸化酶的特性,从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称,BAP,（,Bacterial Alkaline,Phosphatase,），从小牛肠中分离的简称,CIP,（,Calf intestinal Alkaline,Phosphatase,）,.,其主要功能是将,DNA,或,RNA5,端的磷酸切除。,其主要用途有：,A,、在用,P,标记,DNA 5,端之前，去除,5,端的磷；,B,、在,DNA,重组技术中，去除,DNA,片段的,5,磷酸，防,止载体的自身环化。,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,2Pi,寄主修复缺口,载体自连或产生二聚体等,小 结,第一章 导 论,第二章 基因操作的工具酶,第三章 基因克隆的载体,第四章 基因克隆的策略,第五章 克隆基因的表达,第六章 基因工程的基本技术,第二章 基因操作的工具酶,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,第二节,DNA,连接酶及其应用,第三节,DNA,聚合酶及其应用,第四节 修饰性工具酶,1,、限制性核酸内切酶的发现,2,、限制性核酸内切酶的分类和命名,3,、,II,型限制性核酸内切酶的基本特性,4,、限制性核酸内切酶的消化反应,第一节 限制性核酸内切酶及其应用,1,、,DNA,连接酶作用的机理,2,、,DNA,连接酶的反应条件,3,、,DNA,连接的策略,第二节,DNA,连接酶及其应用,1,、大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,2,、,Klenow,片段,3,、,T4 DNA,聚合酶,4,、逆转录酶（反转录酶）,第三节,DNA,聚合酶及其应用,1,、末端转移酶（,terminal,transferase,）,2,、核酸酶,SI,（,SI nuclease,）,4,、碱性磷酸化酶（,Alkaline,phosphatase,）,第四节 修饰性工具酶,基因工程的基本步骤,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,导入植物细胞,思考题,什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？,II,型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？,什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？,酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？,DNA,连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用价值？,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。,Klenow,片段和大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,有何异同？,为什么说逆转录酶（,Reverse transcriptase,）是一种特殊的,DNA,聚合酶，其主要用途是什么？,举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。,为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？,