原核生物RNA的转录课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/9/14,#, 基本概念,；,原核生物转录起始、,RNA聚合酶、启动子；,转录的基本过程；,真核生物,转录起始、,RNA聚合酶、启动子；,转录的基本过程；, 真核生物转录后的加工；, 原核生物与真核生物mRNA的特征比较；, RNA合成与DNA合成异同点；,第一节 若干基本概念,基因表达的第一步；,以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板；,在依赖DNA的,RNA聚合酶,的作用下进行的；,模板单链 DNA的极性方向为3 5, 而非模板单链,DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3；,(书写基因序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向),DNA,3-TACTCAT-5,RNA 5-AUGAGUA-3,5-ATGAGTA-3,Non-template (sense strand),template (antisense strand),按A,U,，C G 配对的原则，合成RNA分子；,RNA,的转录包括,promotion, elongation, termination,三过程, 从启动子（,promoter,）到终止子（,terminator,）称为,转录单位,（,transcriptional unit,）,转录原点记为,+1,，其上游记为负值，下游记为正值, 原核生物中的转录单位多为,polycistron in operon,真核生物中的转录单位多为,monocistron, No operon,+1,-10,+10,upstream,start point,downstream,位于起始位点之,前,的序列称为转录单位的,上游,(Upstream),，起始 位点之,后,(,在,转录序列之,内,),的序列,被,称为,下游,(Downstream),。,转录的不对称性：,在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为,转录的不对称性,。,编码链与模板链,与mRNA序列相同的那条DNA链称为,编码链,；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为,模板链,。,模板链并非永远在同一条单链上,转录方向,5,3,3,5,模板链,编码链,编码链,模板链,转录方向,第二节 原核生物的转录,一、原核生物转录的分子基础；,二、转录的起始，延伸；,三、转录的终止；,四、转录的抗终止。,一、原核生物转录的分子基础：,（一）、RNA聚合酶：,1、,E. coli,的聚合酶负责所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。,一个,E. coli,细胞中约有,7000 个RNA聚合酶,分子。任意时刻大概有,20005000 RNA聚合酶,在合成RNA；,2、,E. coli,的全酶是一个质量约465kD 的分子，由,两个,、亚基及一个,因子所组成。其中，,、亚基构成了,核心酶,，加上,因子之后便构成了,全酶,。,即： 全酶=核心酶+ 因子,（1） ,亚,基的功能：,当,噬,菌,体,T4,感染,E. coli,时，宿主,亚,基,被糖基化修饰,。,修饰,导,致,了,原,来,被,全酶,所,识别,的启动子,亲,和,力,下降,，这就,提,示：,3、各亚基的功能：,亚基在启动子识别中起作用,。,亚基的作用,：,位于前端的,因子使双链解链为单链,；,位于尾端的,因子使单链新聚合为双链,。,核心酶的组建顺序：因子,+, 2+, +,（2）,亚基：,重复使用,(Reusable), 使 Holo-enzyme识别,启动子, 并,与模板链结合, 修饰 RNApol,构型，,降低全酶与,DNA的非特异性结合力,增强全酶与,启动子位点,的特异性结合力,RNA链合成达89个碱基时，因子释放，离开核心酶，由核心酶负责延伸。,因子能够保证细菌RNA 聚合酶稳定地结合到某个特异的、唯一的DNA启动子上。,例如：正,常,情,况,下负,责,大,多,数,基,因,转录的是,70,。,但,32,和,E,在,环,境,变,化（,热激,）时,被,表达,。,28,用于,正,常,生,长,时,鞭毛,基,因,的表,达,。,在大肠杆菌中，,存在多种,因子,。,不同的,因子可以识别不同的启动子序列，从而可以启动不同基因的表达；,大肠杆菌的热,激应,答基因的表达的调控,是,通,过,32实现的。,温,度,升高,时,32,数,量,增,加,，,而,温,度恢,复,32,活性,降,低,来,完成,诱,导,。,32,合成的基,本,信,号,是,温,度,增,加,导,致,未,折叠,蛋白质,(,部分,变,性蛋白质,),在,细,胞,内,累积,。,另一,组,热,调控,基,因的表达是,由,E,因,子,控,制,，,它负,责,对,比,32,更,剧烈,的,温,度,变,化,应,答,。,它,是由,热变性,蛋白质的,积,聚,所,诱,导,的。,大,肠杆,菌细,胞,含,有,少,量,54,，当,培养,基中,缺,乏,氮,时,被,激活,。,在,这,些情,况,下,，基,因被,开启,以,便,利,用,可,替,代,氮,源,。,因子：,促进,RNA pol + NTP RNA elongation ；, 完成 NTP,之间的磷酸脂键的连接,；,与,Rho()因子竞争RNA 3-end 。,因子；,强碱性亚基, 促使RNA聚合酶,与,有义链,（,sense strand,）的结合,总结,：Holo Enzyme,含有的功能位点, sense strand DNA binding point( ), DNA/RNA hybrid site(), D. S.DNA unwinding point(), D. S.DNA rewinding point(),原核生物RNApol (Core) 的结构与功能,Enzyme Movement,DNA coding strand ( ),Rewinding point (),Unwinding point (),RNA binding site,RNA/DNA hybrid (),DNA template strand,10-17bp,总结：大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,亚基,基因,相对分子量,亚基数,组分,功能,rpoA,36500,2,核心酶,核心酶组装，启动子识别。解螺旋及重新螺旋,rpoB,151000,1,核心酶,和共同形成RNA合成的活性中心,rpoC,155000,1,核心酶,？,11000,1,核心酶,？,rpoD,70000,1,因子,存在多种因子，用于识别不同的启动子,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,RNA聚合酶,DNA聚合酶,大小(M),大，4.810,5,dol,小，1.0910,5,dol,引物,无,有,产物,较短，游离,较长，与模板以氢键相连,作用方式,一条链的某一段,两条链同时进行,外切酶活性,无,5 3，3 5,校对合成能力,无,有,修复能力,无,有,（二）、启动子,1、启动子的发现方法：,Promoter region identified by DNAase method,RNA polymerase (no NTP),DNA sequencing,DNase,digestion DNA,+,dissolve,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,通过比较不同基因的启动子序列，发现细菌具有四个保守位点：,起始位点,、,-10,区,、,-35,区,以及,-10,和,-35,区之间间,隔,距,离,。,2、原核生物启动子的特点：,（1）、起始位点通常(90%)都是,嘌呤碱基,。该碱基左右两侧的碱基通常是C（左侧），T（右侧），即：组成,CAT序列,。,启动子定义：,指能被,RNA聚合酶全酶,识别、结合并启动基因转录的一段,DNA序列,。,（2）、在,起始位点,上游,，,在,几,乎,所,有的启动子中,都,可以,发,现,一个,6bp,的区域,。,六,聚物的,中,心,通常靠,近起始点,上游,的,10bp,。该区称为,10区,。,它,的同,源,序列为,TATAAT,。,可被总结为如下形式：T(80)A(95)T(45)A(60)A(50)T(96) ，其中，数字表示碱基出现最大频率的百分数。该区又称为,Pribnow Box。,-10 序列中开始的高度保守的,TA,和最后一个几乎完全保守的,T,是最重要的碱基。,（3）、TTGACA区：,大肠杆菌启动子中另外一个保守区是,以起始位点上游,-35bp为中心的,，称-35区。其共有序列为,TTGACA,，,各碱基出现的频率为：T(82)T(84)G(78)A(65)C(54)A(45)。其中括号数字表示该碱基出现的频率。该区又称为,Sextama Box,。,（4）、在90%启动子中，-35 和-10 区之间的,分隔距离,在,16 到18bp,之间，其中最适距离为,17bp,，这个距离对于启动子启动基因表达效率是最佳的。个别例外的可以,小于15,或者,大于20bp,。,尽管间隔区的真实序列并不重要，但间隔距离大小可以保持两个区恰当的距离，从而使两个区适合于RNA 聚合酶的,几何结构,，所以可以,增加启动子的启动效率,。,原核生物启动子的结构：,典型启动子的结构,-35 -10,转录起点,TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,3、Sextama Box,与,Pribnow Box的功能：,（2）、-10,区序列的,突,变,不,影响,转录闭,合,复,合,体,的,形,成，,但,是其,向,转录,开,放,复合体,的转,变,变,慢,。,（1）、两个区功能的研究方法：利用,碱基突变,来验证序列功能。,该结果表明， -10 区序列组成了启动子的“,解旋域,” (Unwinding domain) 。,（3）、 -35 区序列的突变使,转录闭合复合体,的形成速度,减慢,，但并不抑制其转变为,转录开放复合体,。,因此-35 区序列的功能是为,RNA 聚合酶的识别提供信号,，因此，可以将-35 区序列看作是“,识别域,” (Recognitiondomain) 。,（4）、,Sextama Box,与,Pribnow Box,间距,17bp,有利于,RNApol,启动,17bp,的间距较,17bp,的序列特异性对转录更为重要,（,5,）、,Sextama Box or Pribnow Box mut.,转录率下降,100X,Sextama Box and Pribnow Box mut.,转录率下降,1000X,4、Promoter与,factor,间的作用,二者,结合的专效性,决定了 某个启动子是strong promoter 还是 weak promoter,与标准启动子序列同源性愈高,启动强度愈大,与标准启动子序列同源性愈低,启动强度愈小,若与标准启动子序列差异很大, 则,由另一种因子启动,E.coli,; 4,factor, recognition 4 promoters,Bacillus,; 10,factor, recognition 10 promoters,二、原核生物基因转录的起始过程：,1、全酶,结合到,启动子序列上，,形,成一个,闭,合,(Closed),的,二,元,复,合物,而,开始,反应；,2、与酶结合的一,小,段,DNA,序列的“,溶,解,”,导,致,了,闭,合,复,合,体,转,变,为,开,放,(Open),复,合,体,。对于,强,启动子,来,说,，,闭,合,复,合,体,向,开,放,二,元,复,合物的转,变,是,不可,逆,转的。,（一）、转录的起始：,3、第三,步,是,最,开始的,两,个,核,苷酸,之间的,连,接,。,在它,们,之间,会,形,成一个,磷,酸,二酯键,，这样，,所,产生的,三元复合物,(Ternary complex),就,包,括,RNA,、,DNA,、,聚合酶。,4、当,起始过程完成,后,，聚合酶,释放出,因,子,而,转,变,为,核,心,酶,，,后,者,和,DNA,、新,生,RNA,组,成,延伸,三元复合物,。,接下来加入的,前九个核苷酸,，,聚合酶是一直不移动的,，产生一条短RNA链，直到,九个碱基,为止。九个碱基中的任何一个加入后，聚合酶都有释放RNA的可能性，导致,流产起始,(Abortive initiation)。但流产起始之后聚合酶又开始合成第一个碱基。流产起始常常产生一系列短的寡聚核苷酸(29 个碱基)。,总结：转录的起始,转录,延伸,之,前,，,RNA,聚合酶,要,经,过,数,个,步骤,。,闭,合,二,元,复,合物转化为开,放,二,元,复,合物，开,放,二,元,复,合物,再,转化为,三,元,复,合物。,（二）、起始过程中的RNA聚合酶的形态变化：,1、当,RNA,聚合酶,全酶,最,初,结合到,DNA,上,时，,它,覆盖,了从,-55,到,+20,大,约,75,80bp,的,长度,。,2、,伴,随,因,子的,失去,，聚合酶与,-55,到,-35,的结合,也,失去,，,仅,剩,下,约,60bp,的,DNA,被,聚合酶,所,覆盖,。,这说明：,启动子的上游部分仅参与RNA 聚合酶的起始识别，起始以后便不再起作用,。,3、当,RNA,链,延伸,到,15,20,个碱基时，酶,会,发,生,进,一,步,的,形,态,变,化，转,变,成,负,责,转录,延伸,的,复,合,体,，仅,覆盖,30,40bp,长度,。,RNA,聚合酶,首先,与,-55,到,+20,之间的区域,接,触,，当,因,子,解,离,下,来,后,，,核,心,酶与,-30,左右,的序列结合。,接,着,核,心,酶,向前,移动，结,构,逐渐,致,密,并最,终,形,成,延伸复,合物。,总结：转录起始过程中复合物的变化,象蠕虫一样移动,三、转录的,延伸：,因子释放后，,进入链的延长阶段,1、RNA,合成,在,一个“,转录,泡,(Bubble),”中,进行,，,在,转录,泡,中，,DNA,被,瞬,间,分,离,成单链，其中一条,被,作为,RNA,合成的模板。当,RNA,聚合酶沿,DNA,移动时，,空泡,也,随,之移动。,RNA 链 的 延 伸,3,5,RNA-DNA杂交螺旋,聚合酶的移动方向,新生RNA,复链,解链,有义链,模板链,（,反义链,）,延长部位,DNA,RNA链的合成方向53,各种,结,果,表,明,，,RNA-DNA,杂,交,区的,长度,在,39,个碱基对之间。,所,有,核,苷酸,的合成,都,是从游离核苷酸的,5,-,三磷,酸,基,团,与,RNA,链,末端,的,3,-OH,之间的,缩,合,反应,。,新,加入,核,苷酸,失去,末端,的,两,个,磷,酸,基,(,和,),；,其,磷,酸,基与,RNA,链,形,成,磷,酸,二酯键,。这个,反应,发,生,在,催化位点,。,2、磷酸二酯键的形成：,37,时,反应,速,度,约,为,每秒,40,个,核,苷酸,(,细菌,RNA,聚合酶,),；,这与,翻译,的,速,度,(,每秒,15,个,氨,基,酸,),大致,相同，,RNA,聚合酶,控,制,着,下,一个,核,苷酸,的,加入,。该酶,可能仅,当一个,核,苷酸,与模板,形,成,氢,键,互补,配,对,时,才允许,磷,酸,二酯键,的,形,成。,如,果,该,核,苷酸,与模板,不,匹,配,，,则,将,其,去,除,，,接,着,另一个,核,苷酸,加入,。,3、,延伸的速度：,4、核苷酸加入的控制：,四、细菌,RNA,转录的终止：,1、一,旦,RNA,聚合酶开始转录，酶就沿模板,向前,移动合成,RNA,，直到,遇,到一个,终止子,(Terminator),，聚合酶,停,止,向,正,在,生,长,的,RNA,链,添,加,核,苷酸,，,释放,合成的RNA产物，从,DNA,模板,上解,离,。,终止子：,是RNA聚合酶停止RNA转录的一段DNA,序列,。,终止过程需要所有维持RNA-DNA杂交的氢键断裂，然后DNA 重新形成双螺旋。,2、根,据体,外,实,验,中,RNA,聚合酶是,否,需,要,辅,助蛋白质,参,与终止，,可将,E. coli,中的终止子,分,为,两种,类,型,：,在体外，,没有任何其它因子参与,，核心酶也能在某些位点终止转录，这些位点被称为“,内源性终止子(Intrinsic terminator),”。,“,因子依赖型终止子,”：,体外,需要因子的辅助；突变实验显示,体内,该因子参与了终止过程 。,（1）、,内,源,性,终止子：,A、终止子的结构特点：,内源性终止子有两个明显的结构特点：一个二级结构中的,发夹结构,和转录单位最末端的,连续约6个U 残基,的区段。这两个特点都是终止所必需的。,发夹的,基底部,通常包含一个,富含G:C区,。 发夹和U区段的,典型距离,为,79个碱基,。,有时U区段可以插有其它碱基。,终止子,内部包含能,够,形,成,7-20bp,长度,发,夹,结,构,区。,茎,环,结,构,有,富,含,尿嘧啶,核,苷酸,的,G-C,区。,内,源,性,终止子的结构,B、内,源,性,终止子,终止的机理：,RNA,聚合酶,遇到,发,夹,结,构时,，,RNA,转录产物合成速度,会,减,慢,(,或者是,暂,停,)；,正确,位,置,的一,段,U,残,基是,RNA,聚合酶,遇,到,发,夹,而,暂,停,时从模板,解,离,下,来,所,必需,的。,rU:dA,(RNA-DNA,杂,交,),是一个,不常,见,的,弱,碱基,配,对,结,构,，对,它,的,破坏,所,需,能,量最,少,。当聚合酶,暂,停,时，,RNA-DNA,杂,交,链从终止区的,弱,键,rU:dA,处解,开。,-,依,赖,型,终止作用,所,需,的序列,长,5090,个碱基,，,该区域的,共,同特,征,是,RNA,富,含,C,残,基,而,G,残,基,很,少,。可以在新合成的RNA中形成,松散的发卡结构。,一个,-,依,赖,型,终止子的,终止,效率,随,“,富,C/,少,G,”区域的,长度,而,增,加,。,A、终止子,序列特征,：,（2）、,-,依,赖,型,终止子：,因子是基因编码的蛋白质，是一种酶，它具有,ATPase的活性,和,解链酶,的活性。,6聚化的,因子,在水解ATP的情况下，它沿着53方向转录物的3端前进，直到遇到,暂停,在终止点位置的RNA聚合酶（,因为该区有发卡结构，导致聚合酶的暂停,）。随后因子通过,解链酶,的活性解开,转录泡,（transcription bubble）上的,RNA/DNA形成的杂交双螺旋,，使RNA转录物得到释放，从而终止转录。,B、,因子终止机理：,B、依赖,因子的终止模型：,因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,因,子沿,着,RNA,追赶,聚合酶，当聚合酶,在,依,赖,于,因,子的终止子,处,作,短,暂,停,顿,时,将,其,捕,获,，从,而,导,致,转录终止。,总结：转录的基本过程,五、抗终止：,1、,抗,终止作用,：是在,抗终止因子,的帮助下，,RNA聚合酶,跃,过,终止子,通,读,后,续,基,因,的,能,力,。,抗,终止作用,决,定,RNA,聚合酶,在,终止子位点,处,终止,还,是,通,读,下,去,。,2、抗终止的,意义,：抗,终止,(Antitermination),是,细菌,操纵,子,和,噬,菌,体,基因表达,调控,机制,中的一种,调控方法,。,3、噬菌体感染宿主后基因调控表达的,方式,：,借助宿主的转录系统,表达早期基因,，从而表达出新的因子或合成一种新的噬菌体RNA聚合酶，然后,识别晚期基因启动子（pR）,，启动晚期基因的表达。,噬菌体中的三套基因群：早期基因（,直早期基因,，,迟,早期基因）及,晚期基因,；,58,写在最后,成功的基础在于好的学习习惯,The foundation of success lies in good habits,谢谢,大家,荣幸,这,一路，与你同行,ItS An Honor To Walk With You All The Way,讲师,：,XXXXXX,XX,年,XX,月,XX,日,