分子遗传学3纸板课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,DNA,的复制,复制（,replication,）：是指以原来的,DNA,分子作为模板合成出相同分子的过程。,复制在保持生物稳定性方面起重要作用；,复制是细胞分裂的前提和基础；,复制是精确的复制，一般不会差错；,复制方式为半保留复制（,semiconservative replication,）。,.,第一节半保留复制的验证,半保留复制：亲代,DNA,的两条链解开，每条链都作为模板形成两个子代,DNA,分子；新合成的每个子代,DNA,分子中，一条链来自亲代,DNA,分子，另一条链是新合成的。,半保留模型,（,semioconservetive model,）,全保留复制模型,(conservetive model),分散模型,(Dispersive model),.,.,验证半保留复制的实验,Meselson-Stahl,实验,Taylar,实验,姐妹染色单体差别染色方法,Cairns,复制模型,型复制,.,第二节,复制的起点、方向和终点,一,.,研究方法：,1.,用同位素标记电镜观察：,1973,年,R. L. Rodrigue,等提出的，验证了,E. coli,环状,DNA,是双向复制，一个复制起点，且终点在起点对面。,2.,用噬菌体插入标记法,同步培养,不同步培养,3.,变性定性法,4.,双向电泳法,.,二、原核的复制起点和方向,复制起点（,origin,ori,）：,DNA,分子上特定的发动复制,的起始位点。,复制终点（,terminus,）：,DNA,分子上复制终止的位点。,复制子（,replicon,）：从复制起点到复制终点这样一个,完整的,DNA,单位称为复制子。,原核细胞基因组实质为一条双链,DNA,分子，作为一个复制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；,真核细胞基因组庞大，有多个复制起点和复制终点，含有多个复制子。,.,复制的特点：,E.coli,定点、双向对称复制,;,T7,（噬菌体）在近一端的,17,处开始，向两端延伸,;,枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制,;,一侧复制基因组的,4/5,，另一侧只复制,1/5,，终点也不在,Ori,的对面。,质粒,R,6,K,早期为单向复制，复制了约,1/5,基因组时进行双向复制,;,质粒,Col,E1,有固定起始点，但却为单向复制,;,mt,（线粒体）,DNA,进行,D,（,displaced loop,）环复制。,.,D-,环复制时需合成引物。,mtDNA,为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状,DNA,的复制。复制中呈字母,D,形状而得名。,dNTP,DNA-pol,8,.,复制过程,在研究真核细胞内,线粒体,DNA,的复制时，发现了,DNA,的,D,环复制。复制过程四阶段。,D,环复制的特点是两条链的复制不是同步的。,1.H,链首先合成：在复制起点处以,H,链为模板，合成,RNA,引物，然后由,DNA,聚合酶,催化合成一个,500-600bp,长的,H,链片段。该片段与,H,链以氢键结合，将亲代的,L,链置换出来，产生,D,环复制中间物。新的,H,链,DNA,片段由于分子,3,端终止的位置不定而长短不一,;,也有一些,3,端位置是固定的，而由于,5,端被降解而使整个,DNA,片段长短不一。合成这样,500-600bp,长的,DNA,片段不会引起线粒体,DNA,超螺旋结构的明显改变。,2.H,链片段的继续合成：上述产生的,H,链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体,DNA,完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。,3.L,链合成开始：以被置换下来的亲代,L,链为模板，离,H,链合成起点,60%,基因组的位置开始合成,L,链,DNA,，合成也需要,RNA,引物。,4.,复制的完成：,H,链的合成提前完成，,L,链的合成随后结束。线粒体,DNA,合成速度相当缓慢，约每秒,10,个核苷酸，整个复制过程需要,1,个小时。刚刚合成的线粒体,DNA,是松弛型的，需要,40,分钟将其变成超螺旋型,.,考察基因功能的常用方法,-,突变体的表型变化,突变型可分为二类：一类为可以补偿的；,另一类为不可补偿的；,考察复制有关酶的常用突变型,-,温度敏感突变体,此突变体属于条件致死突变型，即：在,25,正常生长，,42,不能生长致死。,第三节 原核生物复制的酶系统,.,利用大肠杆菌,温度敏感突变体,研究与复制有关基因,(,dna,),一般复制的过程包括：起始、延伸和终止,3,个阶段。每一阶段的蛋白质和酶不完全相同，可利用如下,2,种突变体来筛选。,快停突变体,：温度升高,(42-45,),，复制立即停止。缺失复制体组分的,酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶。,dna,突变体,慢停突变体,：在非允许温度下,(42-45,),，可以完成当前的复制，但不,能开始新的复制。缺失复制起始有关的酶。,.,一、,DNA,聚合酶,(DNA polymerase),全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(DNA-dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,DNA,聚合酶的共同特点：,需要提供合成模板；,不能起始新的,DNA,链；,必须要有引物（一小段,DNA,或,RNA,）提供,3-OH,，在此基础上聚合添加；,合成的方向都是,53,（即子链是,53,）；,除聚合,DNA,外还有其它功能（如校对、修复等）。,.,E.coli,中主要的三种,DNA,多聚酶,DNApol,DNApol ,DNA pol ,结构,分子量,103 KD,90 KD,900 KD,构成,单体,单体,异多聚体,分子数,/,细胞,400,？,10-20,酶活性：,5 ,3,聚合酶,+,+,+,3,5,外切酶,+,+,+,5,3,外切酶,+,(,可切单链,),突变体,突变位点,pol A,pol B,polC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT,突变表型,修复有缺陷,能修复,阻止复制,.,（一）,DNA,聚合酶,I,发现：西班牙裔美国人,A. Kornberg,等在,1956,年完成第一例体外合成,DNA,实验。,从大肠杆菌中分离得到一种酶，此酶可以将核苷酸共价连接在一条已经存在的,DNA,链上，称此酶为,DNA,聚合酶,I,或,Kornberg,酶。,.,单一肽链的大分子蛋白质，分子量约为,109KD,，每个细胞中大约存在,400,个,DNA-pol (109kD),15,.,DNA,聚合酶,I,的结构（要求）,由,PolA,基因编码的单个肽链，,MW,：,103KD,可被枯草杆菌蛋白切成,2,个片段：,小片段位于,N,端,35KD,大片段位于,C,端,68KD,即,Klenow,片段,DNA,聚合酶,I,有,6,个结合位点；,模板结合位点；,(,有引物的,ssDNA,有缺口的,dsDNA),引物结合位点；,(,引物可以是一小段,DNA,或是,RNA),引物,3,OH,结合位点；,底物,dNTP,结合位点；,53,外切酶结合位点；（位于,N,端小片段）,35,校正位点。（靠,C,端大片段偏中间部位）,.,323,个氨基酸,小片段,5-3,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶活性,3-5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,17,.,DNA,聚合酶,的功能（要求）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,1. 53,聚合功能；,主要用于,DNA,的修复和后随链中,RNA,引物的置换。,2. 35,外切活性；,主要起校正功能，切除合成中错配的碱基。,3. 53,外切活性；,(1),切口平移,（,nick translation,）；,(2),链的置换,；,(3),模板转换,（,template-switching,）；,4.,内切酶活性：,主要用于切除修复系统，正常复制中无,。,.,（二）,DNA-pol ,（,120kD,）,DNA-,pol,基因发生突变，细菌依然能存活。,DNA-,pol,对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的,DNA,模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与,DNA,损伤的应急状态修复。,19,.,（三）,DNA,多聚酶,发现：,针对一株,dnaE,基因缺失突变型的研究，其在,25,可以正常生长合成,DNA,，当转移至,43,时，,DNA,的复制过程终止，这表明,dnaE,的表达产物是,DNA,合成所必需的。,证实,dnaE,基因的编码产物是,DNA,聚合酶,III,的,亚基，其具有,53,聚合酶活性。,.,DNA pol ,（,830kD,）,功能：,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,21,.,由十种亚基构成的不对称异二聚体。,2,5,3,聚合酶活性,3-5,外切酶活性和碱基选择功能,维系二聚体的作用,22,.,DNA,多聚酶,结构组成如下图：,.,全酶在,DNA,上的装配分为三个阶段,一个,二聚体加上一个,复合体识别引物模板形成一种前起始复合物；,DNA,在与,、,复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和力使核心酶能与,DNA,结合；,二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。,.,DNA,多聚酶,的功能,53,聚合酶功能：,能催化,DNA,沿,5,3,方向延长,对模板要求高，仅有缺口,100nt,的,dsDNA,才可做模板。,35,外切酶活性：与,DNA,聚合酶,I,相同，有校对功能。,53,外切酶活性：与,DNA,聚合酶,I,不同，仅能以单链为底物，不能进行缺口平移。,DNA,多聚酶,是合成,DNA,的主角，一般合成长片段如前导链和后随链冈崎片段的合成。,.,原核生物的,DNA,聚合酶,26,.,常见的真核细胞,DNA,聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,合成前导链，,参与合成后随链,;,/,复合物,沿着,DNA,模板进行子链的延伸,DNA-pol,在,线粒体,DNA,复制中起催化作用。,DNA-pol,高保真修复，碱基切除修复,DNA-pol,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,DNA-pol,27,.,二、,DNA,连接酶（,DNA,ligase,）,*作用是连接,DNA,分子，将相邻的,3-OH,和,5-P,连接成磷酸二酯键，封闭缺口。,其作用过程分三步进行：,1. E,ATPE,AMP,ppi,在,E.coli,中：,E,NADE,AMP,NMN,2. E-AMP,上的,AMP,转移到,DNA,的,5-PO,4,上使其活化；,3.,活化的,5-PO,4,与相邻的,3-OH,作用形成,3,5,磷酸二酯键，并释放出,AMP,。,*,此酶在后随链的合成、,DNA,的损伤修复、重组及转座中发挥重要的作用。,.,需一段,DNA,片段具有,3-OH,，而另一段,DNA,片段具有,5-Pi,；,需要消耗能量，在原核生物中,由,NAD,+,供能,，在真核生物中,由,ATP,供能,。,未封闭的,切口位于双链,DNA,中,，即其中有一条链是完整的；,DNA,连接酶的催化特点：,29,.,DNA,连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,是基因工程的重要工具酶之,一。,DNA,连接酶的作用：,30,.,三、螺旋酶（,helicase,）,又称解旋酶，是解开氢键促进,DNA,的两条互补链分离的酶。,是,DNA,复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；,具有依赖,DNA,的,ATPase,活性，利用,ATP,水解产生的能量解旋,DNA,并使螺旋酶沿,DNA,链移动。一般每解开一对碱基需要水解一个,ATP,。,与产物单链,DNA,结合，如螺旋酶,，螺旋酶,。,螺旋酶,仅仅催化,DNA,双链的分离，常与,SSB,蛋白结合,如,E.coli,中,rep,蛋白，螺旋酶,。,.,.,四、单链结合蛋白,SSB,（,single binding protein,）,单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白,(helix destabilizing,protein),，可以结合单链，防止形成双链或发夹结构，同时保护单链不被核酸酶水解。,在,E.coli,中，,SSB,是由,177,个,aa,组成的蛋白质,;,以四聚体存在,;,分子量为,74KDa;,结合单链,DNA,可覆盖,32nt,，保护,DNA,。,在原核中,SSB,与,DNA,结合表现出协同效应（第一个,SSB,的结合能力是,1,，则第二个,SSB,的结合能力为,1000,）：,（,1,）,SSB,之间的相互作用；,（,2,）第一个,SSB,和,DNA,的结合改变了,DNA,的结构。,真核生物的复制系统中具有复制因子,A,（,RF-A,）相当于,SSB,，但无协同作用。,.,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,DNA,复制的拓扑性质,五、拓扑异构酶,34,.,DNA,复制时，两条链打开，必然造成,DNA,分子形成缠绕、打结、连环等现象，从而产生扭曲张力。,闭环状的,DNA,按一定方向扭转形成超螺旋。盘绕过分称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋。复制时，部分,DNA,要呈松弛状态。,35,.,拓扑异构酶的作用特点,:,既能水解 、又能连接磷酸二酯键,*,拓扑异构酶,*,拓扑异构酶,拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶（,topoisomerase,）,拓扑异构酶：催化,DNA,环的拓扑异构体之间转化的酶，它可以在切割,DNA,的单链或双链后，催化一个,DNA,分子单链或双螺旋链穿过断裂的单（双）链再重新闭合。,36,.,拓扑异构酶,I,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,如大肠杆菌,DNA,拓扑异构酶,。,拓扑异构酶,II,无,ATP,时，切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能时，使松弛,DNA,分子进入负超螺旋状态，连接断端。,如大肠杆菌的,DNA,旋转酶,(gyrase),又称,DNA,拓扑异构酶,。,DNA,拓扑异构酶的作用机制,37,.,小结：,参与,DNA,复制的酶和蛋白质,主要成员,功 能,DnaA,识别复制起始位,点,解螺旋酶,解开,DNA,双链,SSB,维持已解开单链,DNA,的稳定,引物酶,合成,RNA,引物,拓扑异构酶,使打结、缠绕、正超螺旋的,DNA,松驰,DNA-pol ,DNA,复制延长中起主要作用,DNA-pol,水解引物、填补空隙、修复作用,DNA,连接酶,催化双链,DNA,中单链缺口的连接,38,.,第四节 原核生物和病毒的复制,原核细胞染色体,DNA,的复制起始于固定位点，双向复制；,噬菌体、病毒核酸的复制可以起始于不同位点，双向或单向复制，也可以采取特殊的复制方式，如,滚环复制,。,大肠杆菌,-,环状,DNA,分子,F,质粒,(F,因子,)-,环状,DNA,分子,噬菌体,-,有环状,DNA,分子也有线状,DNA,腺病毒,-,线状,DNA,分子,.,DNA,复制时，在,DNA,合成的复制叉上，分布有各种各样与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为,复制体。,Dna A,Dna B,Dna C,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,复制体结构的变化形成复制的不同阶段。大肠杆菌,DNA,的复制分为三个阶段：,起始,、,延伸,和,终止,。,一、,大肠杆菌环状,DNA,复制的过程,40,.,需要解决两个问题：,1,.,DNA,解开成单链，提供模板,2.,合成引物，提供,3,-OH,末端,（一）起始阶段,41,.,1,解旋解链，形成复制叉,复制起始位点,oriC,的结构特点,:,E.,coli,的复制起点跨度为,245bp,包括,3,组,13bp,串联重复序列,和,2,对,9bp,反向重复序列,作为蛋白结合位点；,富含,A,T,，这可能和双链易于解开起始复制有关；,42,.,.,DnaA,蛋白,识别并结合到复制起始位点（,ori,）的,9bp,重复序列,。,2040,个,DnaA,蛋白各带一个,ATP,相互靠近与,DNA,形成类似核小体的结构。,串联重复序列,（,识别区）,反向重复序列,9bp,重复序列,5,3,5,3,解旋解链：,44,.,形成的复合物促使邻近的,3,个串联重复序列解链。,解螺旋酶（,helicase,DnaB,）六聚体在,DnaC,蛋白协同下，结合到开链的中间复合物上，解开双链，形成两条单链,DNA,，并逐步置换出,DnaA,蛋白。,单链,DNA,结合蛋白,（,SSB,）四聚体,结合在两条单链,DNA,上，使复制叉保持适当长度。,45,.,.,含有,解螺旋酶,(,DnaB,蛋白,),、,DnaC,蛋白,、,引物酶,(,DnaG,蛋白,),和,DNA,复制起始区,域的复合结构被称为,引发体,(,primosome,),。,2,引发体组装和引物合成：,Dna A,Dna B Dna C,引物酶,SSB,3,5,3,5,47,.,引物酶催化合成短链,RNA,引物分子,在引物酶的催化下，以,DNA,为模板，合成一,段,短,RNA,片段,，从而获得,3,端自由羟基（,3-OH,）。,3,OH,5,3,5,3,5,引物,引物酶,DNA,拓扑异构酶,Dna B Dna C,SSB,解链是一个高速的反向旋转，其下游势必发生打结现象，因而需要,DNA,拓扑异构酶参与。,48,.,.,复制的延长指在,DNA,聚合酶催化下，以亲代,DNA,链为模板，从,53,方向聚合子代,DNA,链。其化学本质是,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。,在原核生物中，参与,DNA,复制延长的是,DNA,聚合酶,。,（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制,50,.,*,半不连续复制：在,DNA,的双向复制中，其中,先导链,是沿着复制叉进行延伸，为连续复制，,后滞链,是逆复制叉方向进行不连续复制，每次合成的,DNA,为一个岗崎片段（约,1000-2000nt,），,DNA,的这种复制方式称为半不连续复制。,DNA,的复制方向为,5-3,；,岗崎片段的大小约为,1000nt,，每个岗崎片段的合成都包括新一轮的起始发动的过程；,岗崎片段间的缺口由,DNA,聚合酶,催化填充；,DNA,连接酶连接间断点,DNA,，形成完整的,DNA,链。,后随链的合成过程,.,不连续复制模型：,1968,年日本的冈崎等提出，做了,2,个实验（脉冲标记实验和脉冲追踪实验）验证，复制出的,DNA,片段长约,1000-2000nt,。,半不连续复制模型：,1978,年,B. M.,Olivera,提出，前导链的合成是连续的，后随链的合成是不连续的。片段的形成是因为,DNA,中,U,的混入，被尿嘧啶,N-,糖苷酶切断所致。,复制体和回环模型：,复制体：由解旋酶、引发酶和,DNA,聚合酶,III,全酶组成的复合体，在,DNA,合成中沿着复制叉的方向推进。,回环模型：复制体中，后随链模板形成一个回环，使环中,RNA,引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。,后随链的合成过程,.,催化领头链和随从链是在同一,DNA,聚合酶,的催化下延长的,Pol,为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链,(loop),。,在,DNA,聚合酶,的作用下，,领头链,合成,1000-2000,个核苷酸后，,随从链,开始合成，岗崎片段的长度 为,1000-2000,个（大肠杆菌）,53,.,原核生物基因是环状,DNA,，双向复制的复制片段在复制的终止点,(,ter,),处汇合。,ori,ter,E.coli,72,32,1.,去除,RNA,引物,填补缺口,2.,把,DNA,连接成完整的子链,终止的任务包括,:,（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,54,.,E.coli,的复制终止,现已发现有两对终止区域（,terE,D,A,和,ter C,B,）位于相遇点的两侧约,100Kb,处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的；,ter,顺序有一个,23bp,的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性；,终止需要,tus,(terminus utilization substance),基因的产物,Tus(36kD),，,Tus,能识别,ter,保守顺序，并阻止复制叉继续前进；,ter,-Tus,复合物可能通过抑制螺旋酶,来封闭复制叉的通路,实行终止。,.,在复制过程中形成的,RNA,引物，需由,RNA,酶,来水解去除；,RNA,引物水解后遗留的缺口，由,DNA,聚合酶,（原核生物）催化延长缺口处的,DNA,，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。,1.,去除引物，填补缺口：,56,.,在,DNA,连接酶,的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的,DNA,长链。,2.,连接冈崎片段：,57,.,复制起始,：,解链过程：,DnaA,、,DnaB,（,解螺旋,酶）、,DnaC,引物酶加入,，,形成,引发体,，合成引物。,拓扑酶,、,SSB,的参与。,2.,复制延长：,DNA-,pol,起主要作用；,子链延长方向,5,3,；,领头链连续复制，随从链形成冈崎片段。,3.,复制终止,：,RNA,酶,水解引物；,空缺由,DNA-,pol,催化合成,DNA,填补；,DNA,连接酶,连成完整的子链,等,。,原核生物复制小结：,58,.,二、滚环复制,（,rolling circle replication,）,滚环复制：是小分子量的环状,DNA,分子所采取一种特殊复制形式。,在滚环复制中，先导链借助模板环的滚动复制产生环状分子拷贝。,1968,年,Gilbert,提出,滚环复制模型,:,（,1,）一条链断裂，产生 自由,3,OH,末端；,（,2,）只有一个复制叉,;,（,3,）不需,RNA,引物，在正链,3,OH,上延伸；,（,4,）可形成多联体（,concatemer,）,;,（,5,）模板链和新合成的链分开,;,.,.,进行滚环复制的,DNA,分子类型：,真核,rDNA,的扩增,；,细菌,F,因子,DNA,的转移,；,噬菌体,裂解途经的复制,；,X174,、,M13,、,G4,等病毒的复制；,如：,X174,为单链环状,DNA,噬菌体,，为单正,+,链，其复制第一步是合成一条互补的负,-,链产生双链环；第二阶段复制进行滚环复制。,.,三、线状,DNA,复制起始,及,末端,补齐,线性双链,DNA,的复制有的是从一端开始的，称为末端起始复制。如腺病毒（,Adenovirus,）、,29,DNAs,、脊髓灰质病毒（,poliovirus),。,腺病毒,DNA,全长,35937,bp,线性双链；,两端各有反向重复顺序,103,162bp,，两末端各有,50bp,为复制起点；,其复制是以单链置换（,strand displacement,）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。,线性双链,DNA,复制的末端补齐：,腺病毒利用末端蛋白代替,RNA,引物；,真核生物染色体的末端依赖端粒酶的特殊功能；,.,.,第五节 真核细胞,DNA,的复制,真核细胞中染色体,DNA,的复制是通过许多独立的复制子（复制元）来完成的，每个复制子都有固定的复制起点，采用双向复制；,染色体,DNA,为线性分子，各复制子不一定同时活化，但在细胞的一个分裂周期内只能复制一次；,复制的调控机制尚不清楚；,对真核细胞,DNA,的复制研究常以感染宿主细胞的病毒（,SV40,）复制为基础，因为两者的复制有相似之处。,.,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。,复制有时序性,，即复制子以分组方式激活而不是同步启动。,复制起始点比原核生物短，富含,AT,，称为,自主复制序列（,ARS,，,autonomous replication sequence,）,。,65,.,多,起点、,双,方向,真核生物：,从起点开始，以双向等速进行，一个,DNA,分子上有许多个特定的复制起点。,66,.,真核生物所含的,DNA,聚合酶种类更多：,真核生物,DNA pol,已发现有,5,种，分别命名为：,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制,应急修复。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体,DNA,复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,67,.,增殖细胞核抗原,(,PCNA,),在复制起始和延长中起关键作用。,PCNA,为同源三聚体，具有与,E.coli DNA,聚合酶,的,亚基相同的功能和相似的构象，即,形成闭合环形的可滑动,DNA,夹子，,在,RFC,的作用下,PCNA,结合于引物模板链；并且,PCNA,使,pol,获得持续合成能力。,PCNA,水平也是检验细胞增殖的重要指标。,68,.,（二）真核生物复制的延长发生,DNA,聚合酶,/,转换,DNA-pol,引物酶活性,，,催化合成引物；,DNA-pol,解螺旋酶活性,，,催化合成子链,引物合成后，,DNA-pol,在,PCNA,的协同下,将,DNA-pol,置换出，然后催化合成子链。,冈崎片段长度约为,n135bp(,一个核小体所含,DNA,的量,),随从链合成过程中,DNA-pol,与,DNA-pol,之间的转换频率大。,69,.,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代,DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复制叉的延长：,领头链的连续复制也只限于,半个复制子,的长度,70,.,（三）复制的终止,端粒酶参与解决染色体末端复制问题,1.,去除引物,RNA,酶、,DNA,酶,2.,把,DNA,连接成完整的子链,复制终止阶段需：,71,.,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接,(,与原核生物类似,),染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,(,与原核生物不同,),72,.,真核生物染色体,DNA,是线形结构。,线性,DNA,在复制完成后，其末端由于引物,RNA,的水解可能出现缩短,。,73,.,端粒（,telomere,）,是指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物通过,端粒的特殊复制方式,来解决复制中,DNA,逐渐变短的问题,74,.,功 能,:,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,端粒的结构特点,:,由末端线性,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,T,碱基的短序列。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,75,.,一种,RNA,-,蛋白质复合体，它可以其,RNA,为模板，通过逆转录的方式对末端,DNA,链进行延长。,端粒酶,(telomerase),76,.,端粒酶,RNA (human telomerase RNA,hTR,),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated protein 1, hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT,),人类端粒酶的组成,77,.,DNA,聚合酶复制子链,进一步加工,端粒合成完成,78,.,个人观点供参考，欢迎讨论！,